內生真菌對鐵皮石斛種苗生長的影響

朱彥明，金錦游，崔永一*

(1.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 杭州 311300；2.岱山縣農林水利圍墾局，浙江 舟山 316200)

鐵皮石斛(DendrobiumcandidumLindl.)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物，是我國傳統名貴瀕危中藥材，具有很高的藥用和經濟價值。鐵皮石斛的種植和培育時，往往因缺少有益的內生真菌參與，導致組培苗移栽成活率低，種苗生長緩慢、品質較差，這種狀況限制了鐵皮石斛產業的規模化發展[1]。

內生真菌不同于菌根真菌只能定殖在植物的根部，其存在于植物組織的內部，部分存在于根、莖、葉之中，在植物衰老組織中產生孢子[2]。內生真菌與宿主通過長期的協同進化，與生存在宿主表面的表面菌相比，有本質性的區別，具有更穩定的生態功能[3]。研究發現，內生真菌能夠與植物建立互惠共生的關系,提高植物對營養元素的吸收,促進植物的生長，提高植物對蟲害、病害的抗性和對非生物脅迫的耐受性[4]。

本試驗采用3種內生真菌與鐵皮石斛種苗共生培養的方法，探討內生真菌對鐵皮石斛種苗生長的作用，旨在構建鐵皮石斛共生培養體系，尋求能夠有效促進鐵皮石斛種苗生長、品質提升的新途徑，為鐵皮石斛仿生態栽培、生物肥(菌劑)的研究和應用等方面提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

已移栽馴化的一年生鐵皮石斛種苗，該種苗來自于杭州市臨安成蹊農業科技開發有限公司所生產的天斛一號組培苗。將長勢一致且生長健壯的鐵皮石斛種苗種植于直徑17.5 cm的花盆中。

1.2 處理設計

采用完全隨機試驗設計，共2個因子，分別為供試菌株(FC6、FC8、FC9)和接種體積分數(20%、40%、60%)。以無菌水澆灌為對照(CK)，處理1～3接種FC6濃度分別為20%、40%和60%，處理4～6接種FC8濃度分別為20%、40%和60%，處理7～9接種FC9濃度分別為20%、40%和60%。每處理20盆。由于鐵皮石斛具有較強的群體生長效應[5]，本試驗將種苗以每叢為單位開展研究和生物量測定。試驗材料每盆3叢，共6～9株，重復3次。在常規施肥基礎上(基肥：奧綠肥，每盆5～8顆，3～4個月施用1次。追肥：花寶二號，稀釋1 000倍，春、秋季每半月噴施1次)進行菌液澆灌處理。其中，菌液共澆灌5次，間隔天數為15 d，每盆種苗每次澆灌菌液100 mL。共培養150 d后，調查統計各處理鐵皮石斛種苗生物量，顯微觀察真菌侵染情況。另外從處理組和對照組種苗中隨機抽取10盆進行重分離真菌，并鑒定。

1.3 金釵石斛內生真菌分離純化

從金釵石斛較老的根部向上剪取4～6 cm的小段，洗潔精刷洗干凈，流水下沖洗1 h；在超凈工作臺中用75%乙醇消毒1 min、0.1% HgCl2消毒6 min，最后再用無菌水沖洗3次[6]。無菌濾紙吸干根段表面水分后，先用剪刀把根段兩端剪掉約3 mm，然后再剪成約1 cm長的小段，接于PDA(馬鈴薯、葡萄糖)固體培養基上，進行真菌的分離、純化。另將最后一次沖洗過的無菌水接入PDA固體培養基上作對照，若表面無雜菌產生，表明金釵石斛根部表面消毒徹底。

1.4 內生真菌形態觀察鑒定

將1.3節分離的菌株接種于PDA固體培養基上，然后放置在恒溫培養箱內，暗培養溫度設置為26 ℃。培養7～15 d后，通過菌落特征和顯微觀察初步鑒定篩選菌株。

1.5 內生真菌分子鑒定

將發酵培養(PDA液體培養基)的菌絲球用無菌紗布過濾，再用無菌濾紙吸干后放入研缽中，加入液氮快速研磨至粉末狀，用CTAB法提取真菌基因組DNA，核酸分析儀檢測DNA純度和濃度。分別以通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)為上、下游引物PCR擴增其ITS區。PCR反應體系為25 μL：Master mix(綠酶)12.5 μL，引物(稀釋為10 μmol·L-1)ITS1和ITS4各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，加滅菌ddH2O至25 μL，混合均勻后離心。PCR條件為95 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，25 ℃保溫。PCR反應結束后取4 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

用核酸分析儀檢測擴增后的DNA純度和濃度，取21 μL擴增產物送Sangon公司進行單向序列測通[7]。測序成功的核酸序列以AB1格式保存，運用Chromas軟件進行兩兩比對。以每個形態型菌株的ITS和5.8S基因為靶序列，在GenBank數據庫中用Blast程序搜索同源序列，與已知真菌堿基序列相似度大于或等于97%的菌株被鑒定到種水平，以此為標準鑒定分離純化后的真菌科屬[8]。

1.6 液體菌劑配制

將PDA固體培養基中的菌株用直徑0.5 cm的打孔器在其菌落邊緣打取2個菌餅，接種到300 mL PDA液體培養基中，在溫度26 ℃、轉速200 r·min-1條件下恒溫暗培養約5 d，將懸浮在PDA液體培養基中的菌絲球打碎和發酵液一起與無菌水配制成不同濃度、均勻的液體菌劑[4]。

1.7 生物量測定

鐵皮石斛種苗與內生真菌共培養150 d后，從處理組和對照組中各選取10盆長勢均勻、健壯的植株，以每叢為單位測定植株的鮮質量、干質量、分蘗數、株高、莖粗、莖節數、根長、根條數和葉片數，并計算出各指標平均值。在SPSS 22.0軟件中進行單因素方差分析和多重比較，采用Duncan法分析差異顯著性。

1.8 共生結構觀察

分別從鐵皮石斛種苗處理組和對照組中隨機抽取10盆，每盆取2～3條約5 cm長的根段，在流水下沖洗干凈，剪成約0.5 cm長的小段。迅速放于FAA固定液中，酒精系列脫水、石蠟包埋、切片脫蠟、番紅固綠染色。切片厚度為8 μm，光學顯微鏡400倍下觀察真菌侵染情況并照相記錄。

重分離真菌鑒定方法同1.5節金釵石斛根部真菌分離的分子鑒定法。

2 結果與分析

2.1 內生真菌rDNA ITS序列分析

用CTAB法提取從金釵石斛根部分離所得的3種真菌的菌絲體DNA，PCR擴增均得到單一的ITS片段。將PCR產物測序，獲得3種真菌的rDNA ITS區段的序列，序列長度均在610 bp左右，測序結果在NCBI中利用BLAST與Genbank數據庫中的已知真菌堿基序列進行比對，序列相似度均達到97%以上(表1)。其中菌株FC6和毛殼菌屬ChaetomiumKunze真菌相似度最高；菌株FC8和蠟殼耳屬Sebacinasp.真菌相似度最高；菌株FC9和踝節菌屬Talaromycessp.真菌相似度最高。

表1 內生真菌ITS序列BLAST比對結果

2.2 內生真菌對鐵皮石斛種苗生長的影響

由表2可知，不同菌株、不同濃度處理組對鐵皮石斛種苗的鮮質量有不同的影響。60%菌株FC6處理組鮮質量最大，極顯著高于對照組，是對照組的1.6倍。20%菌株FC6處理組顯著高于對照組。60%菌株FC6、20%菌株FC8處理組的干質量極顯著高于對照組，分別是對照組的1.76、1.63倍。菌株FC6和FC9處理組隨著接種濃度的提高，鐵皮石斛種苗的干質量逐漸增加，而菌株FC8處理組相反。鐵皮石斛種苗經菌液處理后分蘗數明顯增加，20%的FC6、FC8菌株處理組的分蘗數極顯著高于對照組，分別是對照組的2.0、1.1倍。

表2 不同菌株和接種劑量對鐵皮石斛種苗生長的影響

注：*與**分別表示與對照相比在0.05和0.01水平上差異顯著。

60%菌株FC6處理組的株高顯著高于對照組，是對照組的1.26倍。菌株FC9對鐵皮石斛種苗的株高產生抑制作用。菌液處理對鐵皮石斛種苗的莖粗影響較小。在莖節數方面，40%菌株FC8處理組比對照組多出2.72節。20%菌株FC6處理組鐵皮石斛種苗的莖節數低于對照組，提高FC6接種濃度對莖節數的增加有明顯的促進作用。

20%、40%菌株FC6和40%菌株FC8處理組的根長均極顯著高于對照組，分別是對照組的1.74、1.62和1.44倍。菌株FC9處理組的根長小于對照組。20%菌株FC8處理組的根條數極顯著大于對照組，比對照組增加10.92條。鐵皮石斛種苗經菌液處理后葉片的數量有明顯增加。20%、40%、60%菌株FC6，20%、40%菌株FC8和60%菌株FC9處理組均極顯著多于對照組。

2.3 鐵皮石斛種苗真菌侵染情況觀察

鐵皮石斛種苗根部顯微觀察表明，其結構由外到內依次為根被、皮層(外皮層、中皮層和內皮層)和中柱。最外層為根被，由4～6層長筒形、多角死細胞組成，細胞排列緊密，細胞壁增厚。中層為發達的皮層細胞，由10～12層薄壁細胞構成，分布有質粒、淀粉顆粒等結構；中心部分為中柱，是鐵皮石斛根的輸導組織，包括中柱鞘和維管束組織。維管束的數量不一，與其對環境的適應性具有一定的正相關性，另外與植株種類也有一定關系。針狀結晶結構不均勻的分布于整個根部細胞中。

菌株FC6和FC8均能夠侵入鐵皮石斛種苗根部組織，其侵染方式是直接破壞鐵皮石斛種苗根被組織進入皮層細胞，形成菌絲、菌絲結。菌株FC9侵染現象不明顯。菌液處理組鐵皮石斛根部外皮層細胞存在少量菌絲，此層細胞可以清晰地觀察到菌絲由根被細胞向外皮層細胞侵入的現象(圖1中A)。菌絲主要在皮層細胞內形成大量著色較深、形狀不規則的菌絲結(圖1中B)，多數存在于細胞核附近，原因是其圍繞細胞核形成的。在種苗根部也發現細胞中柱外圍的內皮層細胞中分布有大量淀粉顆粒(圖1中E)，皮層細胞中存在著針狀的結晶體，稱為針狀結晶(圖1中F)，其排列不整齊、分布不均勻(表皮細胞中也有少量分布)，顏色較淺，容易識別。有研究表明針狀結晶的化學成分為植酸鈣鎂[9]。

A，菌絲聚集在表皮細胞表面100×，(bar=200 μm)；B，皮層細胞內的菌絲結100×，(bar=200 μm)；C，菌絲團1 000×，(bar=20 μm)；D，菌絲纏繞細胞核現象400×，(bar=50 μm)；E，分布于皮層細胞的淀粉顆粒200×，(bar=100 μm)；F，皮層細胞內的針狀結晶200×，(bar=40.6 μm)。P，菌絲結；CN，細胞核；HB，菌絲團；SG，淀粉顆粒；AC，針狀結晶。圖片均為鐵皮石斛根部的橫切面。圖1 真菌侵染鐵皮石斛種苗情況

2.4 重分離真菌及其rDNA ITS序列分析

對試驗處理組和對照組鐵皮石斛種苗根部進行重分離真菌，處理組均分離得到真菌，對照組未分離到真菌。其中，處理組真菌經純化、形態觀察后初步篩選出與原接種真菌相似的菌株，再分別提取其菌絲體DNA，PCR擴增均得到單一的ITS片段(圖2)。將PCR產物測序結果與原接種真菌序列進行比對，序列相似度均達到99%以上，確定重分離得到了原接種真菌。

M，DL 2 000 Marker；6、8、9分別表示重分離篩選出的與原接種真菌FC6、FC8和FC9相似的菌株。圖2 3種重分離菌株rDNA ITS基因電泳圖譜

3 討論

菌株FC6對鐵皮石斛種苗的鮮質量、干質量、分蘗數、株高、根長和根條數均有顯著促進作用。菌株FC8的促進作用主要表現在鐵皮石斛種苗的分蘗數、根條數和莖節數3個方面。菌株FC9對鐵皮石斛種苗的生長具有一定的抑制作用。本試驗處理的菌株FC6和FC8分離自金釵石斛，但其對同為石斛屬的鐵皮石斛種苗生長也有顯著的促進作用。郭順星等[10]曾在金釵石斛中分離獲得1種能促進鐵皮石斛幼苗生長的菌株，同時也從鐵皮石斛根中分離獲得3種能促進金釵石斛幼苗生長的菌株。另有研究發現，分離自野生美花石斛的菌根真菌對同屬的鐵皮石斛和重唇石斛也有較好的促生效果[11]。這種現象體現了一種植物對多個菌株、一個菌株對多種植物的潛在專一性，以及蘭科植物同屬之間真菌的相似性。

孟娉等[12]研究表明，內生真菌混合接種均具有正效應，但不是全部優于單一接菌。混合接種的效果與混合的方式和方法有關系，這可能是因為共生真菌之間在接種勢、菌絲發展、菌根分泌物、根系生理變化和養分吸收等方面產生了抑制或排斥[13]。而本試驗是采用單一菌株的接種方式處理鐵皮石斛種苗，與混合菌株接種方式的效果差異尚待進一步探討。

石蠟切片法觀察鐵皮石斛種苗根部組織發現，菌株FC6和FC8均能夠在皮層細胞定殖，形成菌絲、菌絲結，表明這2種真菌可以與鐵皮石斛種苗形成典型的共生結構和良好的共生關系，為鐵皮石斛的有益真菌。菌株FC9也可以侵入鐵皮石斛種苗根部根被細胞和少量皮層細胞，但侵染形成的菌絲、菌絲結現象不明顯，對鐵皮石斛種苗的生長產生抑制作用，表明其不能和鐵皮石斛種苗形成共生結構。這可能是相對于另外2種菌株而言，菌株FC9侵染力較弱，無法在有限的時間內與鐵皮石斛種苗形成共生關系[14]。

真菌菌絲多集中分布在鐵皮石斛種苗根部中皮層細胞，而在靠近中柱的內皮層細胞和中柱內分布較少。在鐵皮石斛種苗根部皮層細胞中，真菌多以1條或多條菌絲卷曲，呈現出典型的菌絲圈結構，或變為零碎的菌絲段[15]。一方面真菌利用發達的菌絲幫助寄主植株吸收生長發育所需的碳源、氮源、礦質營養[16]、水分等物質，直接促進植株生長發育；另一方面，消解的菌絲為蘭科植物提供營養物質，菌絲被消解后的復合物中有的成分扮演著誘導子的角色，而后者更為重要[17]。本試驗中菌株FC6和FC8在提高其菌液的接種劑量時，鐵皮石斛種苗的鮮質量、干質量和莖粗等均有增加，這可能與真菌利用其發達的菌絲和消解的菌絲為鐵皮石斛種苗直接或間接提供營養物質有關。