安石榴苷對金黃色葡萄球菌毒力因子表達的抑制作用

徐云鳳 吳 倩 樊秋霞 王 新 夏效東

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；3. 綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川 綿陽 621000)

金黃色葡萄球菌是一類革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在自然界中廣泛存在，對生長環境要求低、環境耐受性強[1]，可污染從農田到餐桌的任何一個環節，給人類健康帶來嚴重的安全隱患。據報道[2]，2011～2016年，在中國由金黃色葡萄球菌導致的食源性疾病爆發案例314起，患病人數5 196人，死亡1人，僅次于副溶血性弧菌和沙門氏菌，位居第3位。在美國，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、彎曲桿菌被認為是污染新鮮農產品的最重要的食源性致病菌[3]。金黃色葡萄球菌能夠產生多種毒力因子，例如溶血素、腸毒素、血漿凝固酶、毒性休克綜合征毒素等[4-5]。這些毒力因子主要為外毒素和侵襲性酶，或作為胞外蛋白分泌到環境中(包括食品基質)，或作為菌體表面蛋白在細菌侵染宿主的過程中發揮作用[6]。金黃色葡萄球菌致病性的強弱在很大程度上取決于其產生的毒力因子[7]，因此研究如何抑制和降低其毒力因子的表達是一個重要的課題。

近年來，由于抗生素的濫用，導致金黃色葡萄球菌出現了不同程度的耐藥性，此外，消費者對合成防腐劑的安全性也存在質疑，很多研究者[8]把目光轉移到天然產物，尤其是植物源天然活性物質上。許多植物化合物，如多酚類、萜類以及生物堿等，在體外研究中均被發現具有一定的抑制微生物生長或毒力因子表達的作用[9-10]。因而從植物中探索安全有效的天然產物用于預防和控制食源性致病菌(如金黃色葡萄球菌)具有十分重要的意義。

安石榴苷是石榴皮中重要的生物活性物質。據報道，安石榴苷具有抑菌[11]、抗病毒[12]、抗氧化[13]、抗炎癥[14]、抗癌[15]等多種生物活性作用。前期研究[16]表明，安石榴苷對金黃色葡萄球菌表現出良好的抑菌效果，最小抑菌濃度(MIC)為0.25 mg/mL，然而安石榴苷對金黃色葡萄球菌毒力因子的表達影響尚不清楚。試驗擬對安石榴苷處理后的金黃色葡萄球菌的溶血活性、凝固酶活性和產腸毒素情況進行測定，并采用反轉錄實時熒光定量PCR技術檢測相關毒力基因的表達情況，以期為金黃色葡萄球菌的控制和安石榴苷的開發利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

安石榴苷：純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；

金黃色葡萄球菌：ATCC 29213，美國模式培養物集存庫，保存于-80 ℃冰箱；

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基、腦心浸液培養基、新鮮無菌脫纖維羊血、凍干兔血漿：北京陸橋技術股份有限公司；

無菌濾膜：0.22 μm孔徑，美國Millipore公司；

總腸毒素檢測試劑盒：德國R-Biopharm公司；

引物：上海捷瑞生物工程有限公司；

石英砂(二氧化硅)：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

溶菌酶：20 000 U/mg，美國Amresco公司；

溶葡萄球菌素、瓊脂糖：美國Sigma公司；

EasyTaq?DNA 聚合酶：北京全式金生物技術有限公司；

細菌總RNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；

反轉錄試劑盒、SYBR試劑盒：寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 儀器與設備

恒溫培養箱：DPX-9082 B-2型，上海福瑪實驗設備有限公司；

超凈工作臺：YT-CJ-IND型，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；

冷凍離心機：5804R型，德國Eppendorf公司；

PCR儀：9600型，珠海黑馬醫學儀器有限公司；

電泳儀：1645050型，美國Bio-Rad公司；

實時熒光定量PCR儀：iQ5型，美國Bio-Rad公司；

臺式恒溫振蕩器：TH2-312型，上海精宏實驗設備有限公司；

酶標儀：680型，美國Bio-Rad公司；

超微量核酸分析儀：Nano-200型，杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備 從冰箱取出金黃色葡萄球菌，于胰蛋白胨大豆瓊脂平板上活化培養。挑取單菌落于裝有腦心浸液培養基的試管中，37 ℃振蕩培養12 h。然后用新鮮無菌的腦心浸液培養基將菌懸液的吸光度調至OD600 nm=0.5(含菌量約為108CFU/mL)。

1.2.2 菌落計數 采用梯度稀釋法將安石榴苷母液在無菌的10 mL離心管中進行稀釋，使其濃度分別為0，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，2 MIC。加入等體積2倍濃度的腦心浸液培養基，使安石榴苷最終濃度為0，1/16 MIC，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，此時培養基的濃度變為1倍正常濃度。將上述菌懸液按照1%(體積分數)的接菌量接入到培養液中，混合均勻，37 ℃，130 r/min 條件下震蕩培養24 h后，進行系列10倍稀釋，涂板計數。

1.2.3 溶血活性的測定 參照Worlitzsch等[17]的方法測定溶血活性，修改如下：將上述菌懸液按1%的接菌量接入到含有安石榴苷的腦心浸液培養基中，使安石榴苷的終濃度分別為0，1/16 MIC，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，37 ℃，130 r/min 條件下震蕩培養24 h，12 000 r/min 離心5 min，將上清液用0.22 μm孔徑的無菌濾膜過濾。取475 μL過濾后的樣品上清液于1.5 mL離心管中，加入25 μL 無菌脫纖維羊血，輕搖混勻，37 ℃孵育2 h。3 000 r/min 離心1 min，吸取200 μL上清液，轉移到96孔板中，450 nm下測定其吸光值。以不含安石榴苷的菌懸液上清作為陽性對照，以無菌腦心浸液培養基經過同樣處理后作為空白對照。

1.2.4 凝固酶效價的測定 吸取0.5 mL無菌生理鹽水加入到凍干血漿西林瓶中，搖勻使之充分溶解，再加入上述不同濃度安石榴苷處理的金黃色葡萄球菌培養液0.3 mL，混合均勻后于37 ℃培養箱內靜置。在6 h以內，每間隔1 h觀察1次結果，若出現凝固現象，即認為待測菌液的血漿凝固酶為陽性，否則為陰性[18]。

1.2.5 總腸毒素的檢測 采用三明治(夾心)酶聯免疫反應法[19]檢測安石榴苷對金黃色葡萄球菌總腸毒素表達量的影響。樣品處理方式同1.2.3，取無菌濾液稀釋5倍后進行檢測。將酶聯免疫試劑盒中所有試劑溫度恢復至室溫，然后于室溫下按照試劑盒說明書進行操作。

將所需數量的微孔條插入到框架中，向每個微量滴定孔中加100 μL樣品或陽性對照，輕搖混勻，包上封口膜，37 ℃孵育1 h；將液體全部倒掉，在吸水紙上輕輕拍打至傾倒完全，加入300 μL洗滌緩沖液，重復操作5次；加入100 μL酶連接物1溶液，用手輕輕搖動使其混勻，封口，37 ℃再孵育1 h；重復洗滌步驟；加入100 μL酶連接物2溶液，輕搖混勻，封口，37 ℃孵育30 min；再次重復洗滌步驟；加入100 μL底物/發色劑，輕搖混勻，封口，在37 ℃ 下避光孵育15 min；加入100 μL反應終止液，在30 min 內用酶標儀在450 nm處測量每個孔的吸光值。

1.2.6 qRT-PCR法檢測毒力基因的表達

(1) 引物序列及特異性檢測：引物序列參照Qiu等[20]所使用的序列。取1 mL在腦心浸液培養基中過夜培養的金黃色葡萄球菌菌液，離心(12 000 r/min,2 min)，棄上清液，加入1 mL無菌水后于干浴器中100 ℃ 加熱煮沸20 min；4 ℃，12 000 r/min 條件下離心5 min，并取上清液作為PCR反應的模板。反應體系如表1所示，反應條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、1 min，35個循環；72 ℃、10 min；4 ℃、10 min。取5 μL PCR產物在1 g/100 mL 的瓊脂糖凝膠中進行電泳，緩沖溶液為0.5 ×TBE。EB染色后在凝膠成像系統下觀察在目標位置有無條帶出現，且有無雜帶。

表1 PCR反應體系Table 1 PCR reaction system μL

(2) RNA的提取：按天根細菌/細胞RNA提取試劑盒說明進行細菌RNA的提取，由于金黃色葡萄球菌細胞壁比較厚，破碎困難，在操作中加入溶葡萄球菌素處理和石英砂震蕩破碎的步驟。

按上述方法進行給藥處理，24 h后，取1 mL菌懸液于1.5 mL無RNA酶離心管中(離心管預先裝有20～30 mg 石英砂，并高壓滅菌處理)，12 000 r/min，4 ℃條件下離心2 min，棄上清，用無菌水洗滌1次；用含3 mg/mL溶菌酶的100 μL TE緩沖液重懸菌體，室溫孵育15 min；加入10 μg/mL溶葡萄球菌素3 μL，繼續孵育5 min；加入350 μL裂解液，渦旋振蕩1 min，冰浴2 min，重復5次，12 000 r/min離心2 min，將上清液轉移至另一離心管中；加入250 μL無水乙醇，混勻，轉入吸附柱中，余下操作按試劑盒說明書進行，最終得到RNA溶液。用微量核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，將RNA的濃度調為一致。

(3) 反轉錄反應：按照試劑盒說明書進行操作。

(4) RT-PCR：按照試劑盒說明書進行操作。反應條件：95 ℃、30 s，1個循環；95 ℃、5 s， 55 ℃、30 s，72 ℃、 30 s，40個循環(熒光定量)；95 ℃、15 s，1個循環；60～90 ℃、30 s，71個循環(溶解曲線)。

毒力相關基因相對定量結果以16S rRNA作為內參，采用2-ΔΔCt法表示。ΔΔCt按式(1)計算。

ΔΔCt=(Ct4-Ct3)-(Ct2-Ct1)，

(1)

式中：

ΔΔCt——處理組和對照組之間校正過的循環數變化；

Ct4——安石榴苷處理組目的基因的平均Ct值；

Ct3——安石榴苷處理組內參基因的平均Ct值；

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Ct2——對照組目的基因的平均Ct值；

Ct1——對照組內參基因的平均Ct值。

1.3 數據處理

所有試驗重復3次，試驗結果以(平均數±標準偏差)表示，使用SPSS 19.0統計軟件分析和處理數據，采用Tukey法進行差異顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 安石榴苷對細菌生長的影響

通過菌落計數得知，起始接菌量為(3.45±0.17)×106CFU/mL。培養24 h后，每個管內的菌落數如表2所示，隨著安石榴苷濃度的增加，金黃色葡萄球菌的數量減少，安石榴苷以濃度依賴的方式抑制金黃色葡萄球菌的生長，在低于1/8 MIC濃度下，安石榴苷對細菌生長的影響較小。

2.2 安石榴苷對金黃色葡萄球菌溶血活性的影響

如圖1所示，安石榴苷能夠抑制金黃色葡萄球菌溶血素的產生。安石榴苷處理組的溶血活性與陽性對照組相比顯著降低，且具有極顯著差異，只有在1/4 MIC濃度下與對照組無顯著性差異，該濃度下所表現出的特異性的原因尚不清楚。總之，安石榴苷對金黃色葡萄球菌的溶血活性有抑制作用，但抑制作用未呈現明顯的劑量依賴性。溶血素作為一種外毒素是造成金黃色葡萄球菌感染的重要的毒力因子[21]，安石榴苷能夠降低溶血素的表達，具有潛在的抗感染作用。

表2 菌落計數Table 2 Cell enumeration CFU/mL

**表示與對照組相比，具有極顯著差異

2.3 安石榴苷對金黃色葡萄球菌凝固酶表達的影響

向血漿中加入金黃色葡萄球菌培養液后，每隔1 h輕輕傾斜西林瓶，觀察是否有凝固現象。結果發現，1 h后，對照組已完全凝固，1 MIC的安石榴苷處理組未發生凝固，1/2 MIC，1/4 MIC處理組呈半凝固狀態，而1/8 MIC和1/16 MIC處理組則完全凝固。連續觀察至6 h，仍為上述結果。可見，安石榴苷能夠以劑量依賴的形式抑制金黃色葡萄球菌凝固酶的表達。血漿凝固酶是一種侵襲性酶，其作用是使血漿中的纖維蛋白在菌體表面沉積和凝固以阻礙吞噬細胞的吞噬[22]。安石榴苷能夠降低血漿凝固酶的表達，從而降低金黃色葡萄球菌的侵襲力。

2.4 安石榴苷對金黃色葡萄球菌總腸毒素表達的影響

*表示與對照組相比，具有顯著差異；**表示與對照組相比，具有極顯著差異

圖2 安石榴苷對金黃色葡萄球菌腸毒素表達的影響

Figure 2 Effect of punicalagin on the expression ofS.aureusenterotoxins

2.5 安石榴苷對金黃色葡萄球菌毒力基因表達的影響

經瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物檢測后，可見凝膠中均為單一條帶，未發現非特異性條帶(圖3)，說明每對引物的特異性良好，可用于后續的RT-PCR反應。由圖4可知，每個基因的溶解曲線均為單個峰，再次說明4個基因的引物的特異性較強，擴增產物單一。

自左向右依次為100 bp DNA分子量標準、sea、hla、agrA、16S rRNA

圖3 待測基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 3 Agarose gel electrophoresis result of PCR products from genes to be tested

圖4 qRT-PCR溶解曲線Figure 4 qRT-PCR dissociation curves

由圖5可知，當安石榴苷的濃度為1/8 MIC時，所檢測基因的相對表達量均有不同程度的下降，腸毒素基因sea和溶血素基因hla的相對表達水平分別是對照組的3%，5%，調節基因agrA的相對表達量為對照組的5%，且均與對照組具有極顯著性差異(P<0.01)；在1/16 MIC濃度下，hla的表達量為對照組的68%，差異極顯著，sea與agrA的表達量與對照組無顯著性差異。安石榴苷對腸毒素表達的抑制作用在mRNA水平與蛋白水平上無很好的相關性，可能是由于mRNA水平代表的是上游轉錄因子的激活，而轉錄后的修飾、翻譯等一系列過程對腸毒素的表達量也有直接影響。金黃色葡萄球菌在對數中后期合成的細胞膜表面蛋白和胞外蛋白受到由多個元件組成的復雜調控網絡的控制，本研究中，通過qRT-PCR技術檢測到安石榴苷對agrA的轉錄有抑制作用，故安石榴苷降低毒力因子的表達部分依賴于agr二元調控系統。

**表示與對照組相比，具有極顯著差異

3 結論

安石榴苷以濃度依賴的方式抑制金黃色葡萄球菌的生長，且對溶血素、血漿凝固酶和腸毒素的表達發揮明顯的抑制作用。安石榴苷能夠顯著減少α-溶血素的產生，但對溶血素的抑制作用未呈現濃度依賴性；在高于1/4 MIC 濃度下安石榴苷能夠降低血漿凝固酶的表達，使血漿未發生明顯凝固；通過酶聯免疫反應法檢測到在高于1/2 MIC濃度下，安石榴苷能顯著降低總腸毒素的產生量；安石榴苷能顯著抑制腸毒素基因sea、溶血素基因hla和調節基因agrA的轉錄。然而，安石榴苷在食品介質中的抑菌和抗毒力因子表達的效果尚不清楚，有待進一步研究。