HPLC法同時測定刺玫果提取物中的黃酮類成分及其體外活性測定

邸 松 鐘方麗 張曉麗,2 王曉林 雷永平

(1. 吉林化工學院，吉林 吉林 132022；2. 吉林大學，吉林 長春 130012)

刺玫果為野生山刺玫的成熟果實，又名花傘薔薇，廣泛分布于東北、內蒙等地[1]。其果實呈卵型或球型，香甜氣息濃郁，酸甜可食[2]。刺玫果含豐富的黃酮類、三萜類、皂苷、揮發油及氨基酸等成分，營養價值極高[3-4]。因其具有抗衰老、預防心腦血管疾病作用，且抗氧化與治療高血脂效果顯著，近年來以刺玫果為主要原料的保健食品的開發受到了廣泛的重視[5]。

在刺玫果提取物黃酮類成分研究的報道中，采用HPLC法定性、定量黃酮類成分的研究較多，其中有同時測定蘆丁、金絲桃苷與槲皮素[6]，木犀草素與金絲桃苷[7]，槲皮素和山奈酚[8]的報道。但尚未見同時測定刺玫果提取物中金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素的報道。有關黃酮類成分體外活性的研究，大多都是總黃酮提取物、或經過純化的總黃酮提取物進行體外活性研究。例如：通過測定DPPH自由基清除率[9]、ABTS自由基陽離子清除率[10]、羥基自由基清除率[11]以及抗脂質過氧化作用[12]來評價其抗氧化活性；通過測定清除亞硝酸鹽活性、阻斷亞硝胺合成能力評價其抗癌活性[13]；通過測定抑制α-糖苷酶活性，評價供試品的降血糖活性[14]。這類試驗只表明了黃酮類成分協同作用的體外活性，未對其黃酮類單體成分及其單體復方配伍活性進行評價。同時也未有對刺玫果提取物中所含的黃酮類成分單體及單體復方配伍的活性研究。

試驗擬使用HPLC法，建立同時測定刺玫果提取物中4種黃酮類單體成分的方法，并分析對比各成分及單體對應復方配伍的體外活性，以期為刺玫果提取物的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

刺玫果：安徽亳州醫藥材料總公司，由吉林化工學院藥學系薛健飛博士鑒定為成熟果實；

木犀草素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品：純度≥98.5%，成都曼思特生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：HPLC級，天津市大茂化學試劑廠；

α-糖苷酶(酶活≥34 U/mg)、PNPG：生物試劑，上海生物科技有限公司；

其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Agilent-1260型，搭載DAD陣列檢測器，安捷倫科技有限公司；

紫外分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限公司；

酶標儀：PL-9602型，北京普朗新科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

(1) 供試品溶液的制備：參考楊揚等[15]對刺玫果總黃酮的提取純化工藝制備刺玫果提取物，采用乙醇熱回流法提取刺玫果總黃酮，使用D-101大孔樹脂對提取的刺玫果總黃酮進行純化，得到刺玫果提取物。精密稱取刺玫果提取物0.5 g，置于25 mL容量瓶中，加入60%乙醇水溶液15 mL，超聲處理30 min使其完全溶解后定容，過濾，取濾液5 mL置于10 mL容量瓶中定容，采用0.45 μm 濾膜過濾，即得供試品溶液。

(2) 對照品溶液的制備：精密稱取金絲桃苷對照品4.2 mg、蘆丁、木犀草素、槲皮素對照品各4.1 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，精密吸取上述各對照品溶液2.5 mL于25 mL容量瓶中并定容，得混合對照品溶液，放置在冰箱(4 ℃)內避光保存備用。

1.2.2 刺玫果提取物中4種黃酮類單體成分的含量測定

(1) 色譜條件及流動相考察：使用紫外分光光度計，在200～600 nm對蘆丁、金絲桃苷、槲皮素及木犀草素的甲醇溶液進行全波長掃描，對比掃描圖譜，選擇4種黃酮類單體成分均具有較大吸收的波長作為檢測波長。使用依利特ODS2C18色譜柱，柱溫35 ℃，進樣量20 μL。分別考察乙腈—0.1%磷酸水溶液、甲醇—0.1%磷酸水溶液、乙腈—甲醇—0.1%磷酸水溶液等度洗脫系統及梯度洗脫系統。根據理論塔板數、分離度、保留時間及峰型因素，從中優選出流動相。

(2) 線性關系的考察：精密吸取混合對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于10 mL容量瓶中，定容，在色譜條件下進樣20 μL，測定峰面積，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。

(3) 方法學考察：① 精密吸取同一混合對照品溶液，在色譜條件下連續進樣6次，分別記錄4種黃酮類單體成分的峰面積，并計算RSD值。精密吸取供試品溶液20 μL，進樣6次，分別記錄4種黃酮類單體成分的峰面積，計算RSD值，考察儀器精密度。② 取同一批刺玫果提取物，按照供試品溶液制備方法進行溶液制備。按照色譜條件進樣6次，分別記錄4種黃酮類單體成分的峰面積，并計算RSD值。③ 吸取同一供試品溶液，分別在0，6，12，24，36，48 h進樣，分別記錄4種黃酮類單體成分峰面積，計算RSD值。

(4) 加樣回收率試驗及含量測定：稱取6份已知含量的刺玫果提取物，每份0.5 g，精密稱定。每份中分別加入金絲桃苷305 μg、蘆丁225 μg、槲皮素94 μg、木犀草素6 μg，按照供試品溶液制備方法進行制備。在1.2.2(1)所選擇的色譜條件下分別進樣20 μL，計算回收率。稱取0.5 g 刺玫果提取物，按供試品溶液配制方法配制供試品溶液，平行進樣3次，記錄4種黃酮類單體成分峰面積，將平均值代入線性關系計算刺玫果提取物中4種黃酮類單體成分含量。

1.2.3 體外活性測定 根據含量測定結果，配制4種黃酮單體成分的復方配伍，并對刺玫果提取物、4種黃酮單體及其復方配伍進行清除自由基、清除亞硝酸鹽、阻斷亞硝胺合成、抑制α-糖苷酶活性的測試。

(1) 清除DPPH自由基清除試驗：參照文獻[16]進行調整。吸取0.1 mg/mL DPPH自由基溶液17 mL于25 mL 容量瓶中，加入無水乙醇定容，制備DPPH自由基溶液。吸取2 mL不同質量濃度的各種供試品溶液(VC溶液、刺玫果提取物溶液、4種黃酮類單體成分及復方配伍溶液)與DPPH自由基溶液，混合，混合液在室溫下避光反應30 min，在517 nm下測定吸光度A樣品，按式(1)計算自由基清除率，并計算IC50值。

(1)

式中：

RDPPH——DPPH自由基清除率，%；

Ak——2 mL無水乙醇與2 mL DPPH自由基溶液混合的吸光度；

Ad——2 mL供試品溶液與2 mL無水乙醇混合的吸光度。

(2) ABTS自由基陽離子清除試驗：參考文獻[17]配制ABTS自由基陽離子工作液。取0.1 mL不同質量濃度的各種供試品溶液與3.9 mL ABTS自由基陽離子工作液混合，23 ℃避光放置6 min，與734 nm測定吸光度，每份樣品平行操作2次，按式(2)計算自由基清除率，并計算IC50值。通過對比IC50，比較VC、刺玫果提取物、4種黃酮類單體成分及復方配伍體外抗氧化活性。

(2)

式中：

RABTS——ABTS自由基陽離子清除率，%；

Ak——0.1 mL水與3.9 mL ABTS自由基陽離子混合吸光度；

Ay——0.1 mL供試品與3.9 mL ABTS自由基陽離子混合吸光度。

(3) 抗脂質過氧化試驗：以抑制率為指標，參照文獻[18]的試驗方法，對VC、刺玫果提取物、4種黃酮類成分單體及復方配伍的抗卵磷脂脂質過氧化作用進行測試。在具塞試管中依次加入1 mL卵磷脂溶液，1 mL 0.4 mmol/L FeSO4溶液及1 mL供試品溶液混勻。于37 ℃ 避光水浴60 min，加入2 mL TCA-TBA-HCl混合液，90～100 ℃水浴15 min，迅速冷卻，以5 000 r/min離心10 min，取上清液在波長535 nm處測定吸光度As?？瞻坠芤? mL重蒸水代替1 mL供試品溶液測得Ac，按式(3)計算抗脂質過氧化抑制率。

(3)

式中：

RZ——抗脂質過氧化抑制率，%。

(4) 清除亞硝酸鹽活性試驗：采用鹽酸萘乙二胺法[19]。在15 mL模擬胃液(pH=3.0)中加入2 mL供試品溶液混合，加入10 μg/mL的亞硝酸鈉溶液2.5 mL，37 ℃ 恒溫水浴反應30 min，取出后立即加入0.4%對氨基苯磺酸溶液0.5 mL，混勻，靜置15 min后加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.25 mL及蒸餾水7 mL，混合均勻，放置15 min。于538 nm處測定吸光度，按式(4)計算自由基清除率，并計算IC50值。

(4)

式中：

RQ——亞硝酸鹽清除率，%；

Ai——加入供試品溶液的吸光度；

Aj——供試品溶液的吸光度；

A0——不加供試品溶液的對照組吸光度。

(5) 阻斷亞硝胺合成活性試驗：采用α-萘胺法[20]。取pH 3.0的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖溶液2.0 mL，加入2.0 mmol/L亞硝酸鈉溶液、2.0 mmol/L二甲胺溶液各0.6 mL、各供試品溶液1.0 mL，混合均勻，加入1.5 mL蒸餾水，37 ℃水浴恒溫反應1 h，用移液管吸取1.0 mL溶液加到直徑7 cm的培養皿中，加入0.5%的碳酸鈉溶液0.5 mL，在254 nm紫外燈下照射15 min，取出后分別加入1%對氨基苯磺酸溶液1.5 mL、0.1%α-萘胺溶液0.5 mL、蒸餾水0.5 mL，搖勻，放置15 min后，用紫外分光光度計在525 nm處分別測定吸光度值，通過式(5)計算阻斷率。

(5)

式中：

RZD——亞硝胺合成阻斷率，%；

A0——未加提取液的比色管中亞硝酸鈉的吸光度；

Ax——加提取液的比色管中亞硝酸鈉的吸光度。

(6) 抑制α-糖苷酶活性試驗：根據賴小燕等[21]試驗方法進行調整。在96孔板中加入80 μL磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)、20 μL 2.5 mmol/L的PNPG底物溶液以及20 μL各供試品溶液，37 ℃水浴10 min。加入20 μL 1.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液反應60 min，用100 μL 0.2 mol/L 碳酸鈉溶液終止反應，室溫放置15 min，用酶標儀在405 nm處測定樣品吸光度值，按式(6)計算抑制率，并計算IC50。

(6)

式中：

RM——α-糖苷酶活性抑制率，%；

Ak——20 μL磷酸鹽緩沖液代替20 μL供試品溶液的吸光度；

Ab——20 μL磷酸鹽緩沖液代替20 μLα-葡萄糖苷酶溶液的吸光度。

2 結果與討論

2.1 刺玫果提取物中4種黃酮類單體成分含量的測定

2.1.1 色譜條件及流動相考察結果 根據紫外分光光度計全波長掃描結果，金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素在204，256，360 nm均具有較大吸收。其中204 nm及256 nm處干擾因素較多，故選擇360 nm作為檢測波長。對比4種黃酮類單體成分在不同流動相下的分離度、理論塔板數及峰型，結果表明：使用甲醇—0.1%磷酸水作為流動相，金絲桃苷和蘆丁相對應的峰重疊，無法分離；乙腈—0.1%磷酸水作為流動相金絲桃苷和蘆丁的分離效果較差；最終確定采用乙腈(A)—甲醇(B)—0.1%磷酸水溶液(C)梯度洗脫，洗脫程序見表1。在色譜條件下分別進樣混合對照品溶液及供試品溶液，混合對照品溶液和供試品溶液譜圖見圖1。

2.1.2 線性關系 以混合對照品中4種黃酮類成分質量濃度為橫坐標，對應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表2。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Flow phase gradient elution procedure

1. 金絲桃苷 2. 蘆丁 3. 槲皮素 4. 木犀草素

標準品擬合方程擬合度R2線性范圍/(μg·mL-1)金絲桃苷y=51.547x+25.3270.995 32.10～21.0蘆丁 y=43.086x+78.2280.995 32.05～20.5槲皮素 y=90.719x+33.2640.999 92.05～20.5木犀草素y=68.102x+34.5851.000 02.05～20.5

表2顯示，金絲桃苷在2.10～21.0 μg/mL，蘆丁、槲皮素及木犀草素在2.05～20.5 μg/mL濃度范圍內與峰面積線性關系良好。

2.1.3 方法學考察 儀器精密度，方法重復性及供試品溶液48 h內穩定性的RSD值均在3%以內，表明儀器精密度，方法重復性以及供試品溶液48 h內穩定性良好，試驗結果見表3。

表3 方法學考察試驗數據Table 3 Methodological experimental data (n=6) %

2.1.4 加樣回收率及含量測定 4種黃酮類單體成分金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素的平均加樣回收率分別為98.02%，98.45%，99.15%，98.46%，RSD值分別為0.80%，1.92%，2.12%，2.89%。具體試驗結果見表4。含量測定結果顯示刺玫果提取物中金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素的含量分別為607.98，450.63，187.32，12.68 μg/g，結果見表5。

2.2 體外活性測試

2.2.1 DPPH自由基清除試驗 從圖2可以看出，刺玫果提取物、4種黃酮類成分及復方配伍(金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素按質量比為47.9∶35.5∶14.8∶1.0進行混合得到4種黃酮類成分單體復方配伍)均具有一定的清除DPPH自由基活性。其中刺玫果提取物、蘆丁、木犀草素及復方配伍的活性弱于VC，槲皮素及金絲桃苷活性強于VC。刺玫果提取物清除DPPH自由基的活性較陽性對照Vc雖然較弱，但是IC50較為接近，與孟永梅等對刺玫果提取液清除DPPH自由基活性的研究結果相當[22]，但弱于黃刺玫乙酸乙酯層萃取物[23]。

2.2.2 ABTS自由基陽離子清除試驗 從圖3可以看出，各樣品均具有較強的清除ABTS+.的活性。其中槲皮素的清除能力最強，IC50值為29.5 μg/mL；復方配伍的清除能力最弱，對應IC50值為196.2 μg/mL。槲皮素為五羥黃酮，其2、3位有雙鍵，3、7位有兩個羥基，可通過單電子轉移直接清除自由基[24]，所以具有極強的抗氧化活性。但由于刺玫果提取物中所含有的槲皮素較少，所以刺玫果提取物的抗氧化能力弱于槲皮素。

2.2.3 抗脂質過氧化試驗 從圖4可以看出，槲皮素具有較強的抗脂質過氧化作用，其活性強于VC，其IC50值為0.058 2 mg/mL。其他成分抗脂質過氧化作用由強到弱的順序為金絲桃苷、木犀草素、刺玫果提取物、蘆丁及復方配伍。復方配伍組活性相較于刺玫果提取物明顯降低，說明刺玫果提取物中應該含有其他具有較高體外活性的成分，由于天然產物結構中的酚羥基易被氧化成醌，從而具有較高體外抗氧化的活性，綜合分析認為刺玫果提取物中應該含有一定量的多酚類成分。

表4 加樣回收率結果Table 4 Result of recovery tests

表5 樣品測定結果Table 5 Results of samples determination

2.2.4 清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成活性試驗 在體外模擬胃液條件下，分別考察了刺玫果提取物、4種黃酮類單體及復方配伍的清除亞硝酸鹽活性和阻斷亞硝胺合成活性，試驗結果分別見表6、7。

從試驗結果可以看出，刺玫果提取物、4種黃酮類成分單體及復方配伍，均具有一定的清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成活性。其中木犀草素清除亞硝酸鹽的活性最強，強于VC的清除活性；復方配伍阻斷亞硝胺合成活性為樣品中最好的，但弱于VC。刺玫果提取物能有效阻斷亞硝胺合成，其活性略低于復方配伍，而復方配伍的活性強于各單體本身，說明配伍后可能存在協同增效作用。

2.2.5α-糖苷酶抑制活性試驗 從表5中可以看出，刺玫果提取物、槲皮素及木犀草素的抑制活性優于阿卡波糖，且槲皮素的抑制活性最強；蘆丁、金絲桃苷及復方配伍活性低于阿卡波糖，但也具有一定的抑制活性。雖然刺玫果提取物具有較強的體外降血糖活性，且活性強于桑葉總黃酮[25]。槲皮素對α-糖苷酶抑制活性，但刺玫果提取物中槲皮素的含量較低，所以刺玫果提取物中的降糖活性成分及機理還有待進一步研究。

圖2 樣品對DPPH·清除能力半抑制濃度比較

Figure 2IC50comparisons among clearance rate of DPPH· for the tested sample

圖3 樣品對ABTS+·清除能力半抑濃度比較

Figure 3IC50comparisons among clearance rate of ABTS+· for the tested sample

圖4 各成分抗脂質過氧化作用半抑制濃度比較

Figure 4IC50comparisons among clearance rate of anti-liposome peroxidation effect for the tested sample

表6 清除亞硝酸鹽試驗結果Table 6 Results of sodium nitrite removal test

表7 阻斷亞硝胺試驗結果Table 7 Test results of blocking nitrosamine

表8 抑制α-葡萄糖苷酶試驗結果Table 8 Results of inhibiting enzyme activity of α-glucosidase

3 結論

研究建立了HPLC同時測定刺玫果提取物中4種黃酮類成分單體含量的方法，采用該方法測定的刺玫果提取物中金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及木犀草素的含量分別為607.98，450.63，187.32，12.68 μg/g，研究結果表明建立的高效液相色譜含量測定方法具有良好的精密度，線性關系良好，結果準確可靠，可用于刺玫果提取物中黃酮類成分的含量測定。

大量研究[26-27]證實刺玫果提取物具有較好的體外活性，但均未對提取物與其中的黃酮單體及單體復方配伍的體外活性進行對比研究。體外試驗結果表明刺玫果提取物具有較好的體外抗氧化和降糖活性，在天然抗氧劑、降血糖以及保健食品的開發與應用方面具有廣闊的發展前景。刺玫果提取物能有效地清除亞硝酸鹽，具有較好的阻斷亞硝酸鹽合成活性，可有效預防致癌、致畸及智力遲鈍的發生[28]。刺玫果提取物有中含有較多的活性成分，試驗只對其中的4種黃酮類化合物進行了定量分析，尚未對其做進一步的化學成分分離，其主要活性成分有待于進一步研究。