亮氨酸和α-酮戊二酸對小鼠體重、血清及臟器的影響

金順順 姚 康 印遇龍 康寶聚 黎育穎 王 鵬

(1. 中國科學院亞熱帶農業生態研究所，湖南 長沙 410125；2. 中國科學院亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南 長沙 410125；3. 中國科學院大學，北京 100049；4. 湖南農業大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, AKG)是三羧酸循環的關鍵中間體[1]，也是谷氨酰胺脫氨(谷氨酰胺水解)的產物。其在臨床和動物營養方面發揮著有益的作用，能改善動物生長性能、調節能量代謝、提高動物免疫力、促進骨骼肌蛋白質合成等[2]。體外研究[3]發現，AKG能通過促進豬腸道上皮細胞蛋白質的合成和降低蛋白質的分解來促進豬腸道上皮細胞蛋白質的合成。亮氨酸(leucine，LEU)是必須氨基酸，也是支鏈氨基酸之一[4]，還能在動物體內影響脂質代謝，主要是通過抑制脂肪的合成[5-7]以及促進脂肪的分解[8-10]來發揮作用。據報道[11]，亮氨酸能調節哺乳動物骨骼肌蛋白質的代謝，從而達到促進動物生長的作用。肖定福等[12]研究表明，在動物體內谷氨酰胺向AKG轉化的過程中，首先谷氨酰胺由磷酸鹽活化谷氨酰胺酶反應產生谷氨酸，再通過線粒體中谷氨酸脫氫酶的作用或通過轉胺作用在細胞溶膠或線粒體中產生AKG，這個代謝過程中，亮氨酸是谷氨酸脫氫酶的激活劑，因此，在生物體的代謝過程中亮氨酸和AKG存在協同作用。這預示著亮氨酸和AKG可能對機體內骨骼肌蛋白質的合成代謝有協同作用。而加強骨骼肌蛋白質的合成是解決肌肉萎縮的重要一步[13]。骨骼肌蛋白的合成已被證明受到不同營養和生理因素的影響，如氨基酸[14]、葡萄糖[15]、運動[16]、胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor -1，IGF-I)和胰島素[17]等。綜上所述，亮氨酸和AKG兩者都對小鼠的生長性能和骨骼肌產生影響，且兩者在生物體內代謝過程中存在協同作用，然而聯合使用AKG 和亮氨酸對健康小鼠生長以及骨骼肌的影響，目前未見報道。因此試驗探討了亮氨酸和AKG聯合使用對小鼠的體重，血清生化指標、器官指數和骨骼肌纖維的影響，以期為運用亮氨酸和AKG改善蛋白質降解引起的肌肉萎縮提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

AKG：有效成分含量為99.5%，武漢遠成共創科技有限公司；

亮氨酸：有效成分含量為98%，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

冷凍型大容量離心機：4K15型，德國Sigma公司；

生化分析儀：cobas c311型，瑞士羅氏公司；

電子天平：GL124-1SCN型，深圳市盛美儀器有限公司。

1.1.3 試驗動物與飼糧

試驗動物：4周齡的雄性C57BL/6小鼠，體重(12.76±0.67) g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；

小鼠專用飼料：主要營養水為粗蛋白質(CP)20.50%、粗脂肪(EE)4.62%、鈣(Ca)1.23%、磷(P)0.91%、賴氨酸(Lys)1.30%、蛋氨酸+胱氨酸(Met+Cys)0.68%、亮氨酸(Leu)1.40%，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 試驗設計

將40只C57BL/6小鼠于21～25 ℃、相對濕度60%的飼養房中飼養1周后，隨機分為4組，每組10只。對照組：水瓶中加入正常的飲水；Ⅰ組：水瓶中加入1.0%的AKG(每千克水中加入10 g AKG，并調節pH值至7.4)；Ⅱ組：水瓶中加入1.8%的亮氨酸(每千克水中加入18 g亮氨酸)；Ⅲ組：水瓶中加入1.8%的亮氨酸和1.0%的AKG(每千克水中加入18 g亮氨酸和10 g AKG，并調節pH值至7.4)。試驗期35 d。

1.3 樣品的采集

試驗結束后，各組小鼠禁食(自由飲水)12 h，對所有小鼠進行眼球摘除采血，將采集的血液置于離心管中，低溫(4 ℃)下靜置30 min，離心10 min (4 ℃、3 000 r/min)，于-20 ℃保存備用。采血后，對小鼠采用脊椎脫臼法處死，迅速取出心臟和肝臟。將心臟和肝臟用預冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分后稱重；取腹部脂肪、肩周脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、趾伸長肌、腓腸肌稱重并留用。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 體重 在正式試驗開始和結束時利用電子天平對每只小鼠分別進行稱重，分析體重變化。

1.4.2 器官指數的測定 在試驗結束后屠宰小鼠，取心臟、肝臟、腹部脂肪、腎周脂、皮下脂肪、腓腸肌、趾長伸肌稱重并記錄。心臟、肝臟、腹部脂肪、腎周脂、皮下脂肪指數的計算參照丁曉東等[18]的方法，腓腸肌和趾伸長肌指數的計算參照石鶴坤等[19]的方法。

1.4.3 血清生化指標的測定 采用全自動血液生化分析儀對總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、血氨(BA)進行分析。每組10個重復。

1.4.4 腓腸肌橫截面積的測定 腓腸肌橫截面積的測定于腓腸肌統一位置切取組織塊(0.6 cm×0.6 cm×0.6 cm)浸入10%中性福爾馬林溶液中固定，經脫水、透蠟、包埋，切片后，進行HE染色，光學顯微鏡進行觀察，每個切面選取10個圖片，然后用Image-Pro plus 6.0軟件分析肌纖維的橫截面積(Cross Section Area, CSA)。

1.5 數據分析和處理

試驗結果用(平均值±標準誤差)表示，采用SPSS 20.0進行單因素方差分析，模型顯著時采用Duncan氏多重比較檢驗。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 AKG和亮氨酸對小鼠體重變化的影響

由表1可知，在連續飼喂35 d中，各組小鼠均未出現任何異常反應。在試驗結束第1周，3個處理對小鼠的體重均未產生顯著影響(P>0.05)；在第14天和第21天時，Ⅰ組小鼠體重顯著高于Ⅲ組(P<0.05)，其他各組之間無顯著性差異(P>0.05)；試驗第28天時，Ⅲ組小鼠體重顯著低于Ⅰ和Ⅱ組(P<0.05)，其他各組之間無顯著差異(P>0.05)；試驗第35天時，Ⅲ組小鼠的體重顯著低于Ⅰ組、Ⅱ組和對照組(P<0.05)，其他各組之間無顯著差異(P>0.05)。小鼠飲水中添加亮氨酸和AKG較其他3組體重有降低的趨勢。原因可能是動物機體內由磷酸鹽活化谷氨酰胺酶反應所產生的谷氨酸能通過線粒體中谷氨酸脫氫酶的作用或通過轉胺作用在細胞溶膠或線粒體中產生AKG，在這個代謝過程中，亮氨酸是谷氨酸脫氫酶的激活劑，因此可以強化AKG的作用。另外AKG也可參與脂質代謝和肉堿的形成[20]。而肉堿是一種作為脂肪酸載體進入細胞線粒體的分子，在線粒體中可以進行適當的脂肪分解代謝從而起到降低體重的作用。

2.2 AKG和亮氨酸對小鼠血清生化指標的影響

由表2可見，與對照組相比，Ⅲ組血清TP、ALB和ALP含量顯著升高(P<0.05)，BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組血清BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)，Ⅰ組血清BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅲ組血清ALB含量顯著提高(P<0.05)，Ⅱ組血清UA含量顯著增加(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組血清ALB含量顯著升高(P<0.05)，BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)。各組間其他血清生化指標均無顯著性差異(P>0.05)。血清中TP的含量可直接反映蛋白質的吸收情況以及機體體液免疫的健康狀況，從而間接反映機體對外界不良因素的抵抗能力，血清TP含量高說明蛋白質合成作用、氮沉積及機體對外界不良因素的抵抗能力增強[21]。聯合運用亮氨酸和AKG能顯著升高血清ALB和TP的含量，表明兩者可提高機體的體液免疫能力及肝臟對蛋白質的合成作用。ALP是遺傳標記的同工酶，其活性的高低能反映骨組織生長、鈣磷代謝、脂肪代謝狀況[22]。聯合運用兩者能顯著提高血清ALP的活性，可能與AKG可顯著提高粗蛋白、鈣和磷的表觀消化率有關[23]。同時聯合運用兩者有利于氨基酸平衡，促進蛋白質代謝以及降低血清中尿素和UA的含量[24]。

表1 試驗期間各組小鼠體重的變化?Table 1 Change of body weight of mice from different groups during the whole experimental period (n=10) g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

? 同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 AKG和亮氨酸對小鼠器官指數的影響

由表3可知，Ⅲ組心臟指數顯著高于對照組、Ⅰ組和Ⅱ組(P<0.05)。其他各組間器官指數均無顯著性差異(P>0.05)。聯合運用亮氨酸和AKG能顯著提高心臟指數，表明兩者聯合運用能減少外界不良因素對心臟的損傷，促進心臟的生長[25]。

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 AKG和亮氨酸對小鼠脂肪指數和肌肉指數的影響

由表4可見，與對照組相比，Ⅱ組和Ⅲ組腹部脂肪指數顯著降低(P<0.05)，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組腓腸肌指數顯著增加(P<0.05)，Ⅲ組趾長伸肌指數顯著增加(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅲ組腓腸肌指數和趾長伸肌指數顯著增加(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組腓腸肌指數和趾長伸肌指數顯著增加(P<0.05)。其他各組間脂肪指數和肌肉指數均無顯著性差異(P>0.05)。聯合運用亮氨酸和AKG能顯著提高腓腸肌指數和趾伸長肌指數，說明1.0% AKG 和1.8%亮氨酸聯合添加在促進骨骼肌生長方面有協同作用。

2.5 AKG和亮氨酸對小鼠腓腸肌橫截面積的影響

由表5可知，與對照組相比，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的小鼠腓腸肌橫截面積顯著增加(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅲ組的小鼠腓腸肌橫截面積顯著增加(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組的小鼠腓腸肌橫截面積顯著增加(P<0.05)。其他各組間小鼠腓腸肌橫截面積均無顯著性差異(P>0.05)。具體的原因可能是：① AKG能促進骨骼肌蛋白質的合成和抑制骨骼肌蛋白質的降解，從而使得肌纖維的橫截面積增大；② 亮氨酸也能促進骨骼肌蛋白質的合成，從而使得肌纖維的橫截面積增大；③ 在谷氨酰胺、谷氨酸和AKG的相互轉化過程中，亮氨酸促進谷氨酸向AKG的轉換，而兩者之間存在的協同作用加速了肌纖維蛋白質的合成，從而使得肌纖維的橫截面積增加。

表4 AKG和亮氨酸對小鼠脂肪指數和肌肉指數的影響?Table 4 Effect of AKG and leucine on fat index and muscle index of mice (n=10) %

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表5AKG和亮氨酸對小鼠腓腸肌橫截面積的影響?

Table5EffectofAKGandleucineoncrosssectionalareaofgastrocnemiusmuscleofmice(n=10)

組別腓腸肌橫截面積/μm2對照組1 873.08±124.16c試驗組Ⅰ2 289.84±101.02b試驗組Ⅱ2 151.39±78.89b試驗組Ⅲ2 751.94±81.13a

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論

試驗通過對C57BL/6 雄性小鼠研究，比較亮氨酸和AKG對小鼠體重和骨骼肌發育的影響，結果表明亮氨酸和AKG聯合運用具有抑制小鼠體重增加，促進心臟生長，加強器官對脂肪的利用和增加腓腸肌纖維的重量和橫截面積的作用。研究為提高肌纖維橫截面積預防肌肉萎縮提供了新的思路，然而其調節骨骼肌代謝的作用機理還有待進一步研究。