高寒半濕潤沙地草本修復期土壤微生物變化研究

帥林林, 周青平*, 陳有軍,2, 茍小林,2, 周蓉

(1.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016；3.阿壩州茂縣農業畜牧和水務局，四川 阿壩 623200)

土壤由有機質、礦物質、微生物、水等組成，是植物賴以生存的載體，也是微生物生長繁殖的重要場所[1-2]。有機質和礦物質是構成土壤養分的主要結構，是植物和微生物生長發育所需營養的關鍵之源[3-5]；同時土壤微生物在土壤養分循環和積累過程中起著重要的作用。土壤微生物通過分解地表凋落物和地下植物根系殘體，參與土壤養分的循環與轉化等過程[6]；而微生物多樣性和微生物生物量也能對土壤質量變化產生影響[7]，微生物多樣性通過改變微生物功能群落影響土壤中養分循環過程，對土壤養分過程進行調控。微生物生物量也是土壤中養分的重要組成，對土壤養分循環具有積極作用。因此，土壤微生物多樣性和微生物生物量的格局變化，不僅能夠影響土壤養分轉化，并且可能干擾植物繁殖代謝過程，所以，微生物生物量和多樣性的變化是影響土壤生態系統平衡與穩定的重要因素。

青藏高原東南緣是我國典型半濕潤高寒草地分布區[8]。該地區作為全國第二大藏區，是長江、黃河重要水源涵養地，同時也是高原人民生產、生活所需資料的重要來源地。近幾十年來，由于受氣候變化和人類活動等的影響，高寒草地遭受破壞，部分地區生態系統退化[9]；尤其是在青藏高原東南緣的日干喬濕地保護區，受過度放牧、人類活動、全球變暖等的影響，使沙化急劇擴張，甚至已經成為生態系統安全的重大威脅[10]，是當地經濟可持續發展的重大阻礙，因此亟須開展生態治理。

灌草作為高寒地區的重要植物資源，已經在高寒沙地修復過程中被廣泛運用[11-13]。目前研究者們對沙蒿(Artemisiadesertorum)、檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)等灌木種植模式進行沙地治理的研究較為深入[14-15]，而采用高寒草本進行沙地修復的研究較少，特別是混合草本恢復模式下高寒沙地土壤養分與土壤微生物動態變化的相關研究極為缺乏，這對脆弱的高寒生態系統進行沙地修復理論指導極為不利。因此，根據周青平等[16]和梁國玲等[17]在高寒沙地治理過程中進行的牧草品質分析，篩選出的適合高寒地區生長的牧草品種;本研究以適生性燕麥(Avenasativa)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、中華羊茅(Festucasinensis)3種草本混播，對日干喬濕地自然保護區高寒半濕潤沙地進行植被修復，通過研究土壤養分和土壤微生物含量隨沙地植被修復過程的動態變化，為青藏高原半濕潤沙地草本種植修復過程提供基礎研究理論。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

研究區域位于四川省阿壩州紅原縣日干喬濕地自然保護區(31.51°-33.19° N、101.51°-103.23° E， 海拔3460 m)。其位于青藏高原東南緣，氣候為半濕潤氣候，年降水量可達750 mm以上[18]。該區為典型的半濕潤高寒草地，高溫和降水主要集中于每年5-9月，年平均氣溫為1.1 ℃，極端高溫出現在每年的7月，為26 ℃，極端低溫出現在每年的12月，為-36 ℃(圖1)。該地區冬季漫長，從11月一直持續到來年4月初，冬季土壤凍結，地表覆蓋雪被。土壤表層主要為高寒草甸土，地表植物主要是適應高寒環境的中國沙棘(Hippophaerhamnoides)、沙蒿、柳樹(Salixatopantha)、鵝絨委陵菜(Potentillaanserina)。

圖1 研究區域2013-2016年日均溫度和日降水量Fig.1 The daily average temperature and daily precipitation in study area from 2013 to 2016

1.2 植被修復試驗

在研究區選擇不同的種植區域，具有相似的地形、地貌特征，相同的土壤類型。將篩選的燕麥、垂穗披堿草、中華羊茅按照種子重量比10∶3∶3的比例混播，利用尖頭開溝器進行溝播，播深5 cm，行寬10 cm，建植成0.5 m×0.5 m的菱形方格，覆土5 cm，形成草方格。保障種植面積內燕麥達到450萬株·hm-2，所以混合種子的播種量為160 kg·hm-2，后期圍欄封育管理，在每年的5月初進行混合草本種植，分4年進行播種，種植年限分別為修復1年(2016年種植)，修復2年(2015年種植)，修復3年(2014年種植)，修復4年(2013年種植)，對照組為與種植區域相鄰的空白沙地。每個試驗區域具有3個0.5 km×1.0 km的重復樣地，每個重復的試驗樣地之間被10 m寬的柳樹隔離帶進行隔離。

1.3 樣地設置及樣品采集處理

根據不同的種植年限，選擇地表植被調查的樣地。采用時空替換方法，即利用空間的變換來代替時間的變換，用空間上不同草地修復程度來替代草地在時間上的修復順序[19-20]。于2016年8月中旬在研究區內對不同恢復期的樣地進行樣品采集。在處理區和對照區分別隨機選擇3塊100 m×100 m的樣方，在每塊樣方內沿對角線分別選取3個10 m×10 m的樣斑，每塊樣方內的3個樣斑即為3個重復。在樣斑內隨機用內徑為5 cm的土鉆采集0～10 cm和10～20 cm 的土壤(受高寒地區氣候、降水等條件影響，沙化治理一年生燕麥主要根系分布在20 cm左右，而多年生長的草本根系受到生長年限和季節性影響，草本根系也大量分布于20 cm內，因此沙地草本根系主要分布在0～20 cm土層[21])，分別將樣斑內采集的3個土壤樣品混合為一個樣品，每塊樣地內3個重復，將混合后的樣品保存于放有冰袋的泡沫箱中，低溫環境下迅速帶回實驗室進行樣品分析。依據草本生長特性和野外草本樣方調查方法[22]，在3個樣地中分別沿對角線選擇3個1 m×1 m 的樣斑，用于統計樣斑內植物物種、群落蓋度、植物分布特征等。

土壤樣品帶回實驗室后過1 mm篩, 去除沙土中的石子和根系等雜物。將過篩后的土壤分為2份: 一份用于土壤理化性質的測定；一份用于土壤微生物特性的測定。

1.4 測定方法

土壤基礎養分測定：將風干的土壤利用研缽磨碎后，過0.5 mm篩。采用重鉻酸鉀-外加熱法測定土壤有機質，采用凱氏定氮法測定全氮含量，采用鉬銻鈧比色法測定全磷含量[23]，各項指標分別測3個重復，取平均值。

微生物生物量測定：土壤微生物生物量碳、氮、磷利用氯仿熏蒸方法進行測定[24]。稱取過篩后新鮮土壤20 g兩份，20 ℃下一份用氯仿熏蒸24 h，一份不做處理。2份土壤測定的差值確定微生物生物量碳、氮、磷的值。利用重鉻酸鉀外加熱氧化，硫酸亞鐵鹽滴定方法測定微生物生物量碳[25]；利用靛酚藍比色法測定微生物生物量氮[26]；利用鉬銻抗比色法測定微生物生物量磷[27]。

微生物多樣性測定：采用磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid, PLFAs)法[28-29]，稱取1 g土壤樣品與按1.0∶2.0∶0.8的比例配制的甲醇、氯仿、檸檬酸鹽溶液混合，離心，收集上清液，加入提取液，振蕩2 h，再離心，收集上清液，分別加入10 mL的氯仿和10 mL的丙酮洗去中性脂和糖脂，最后用10 mL甲醇淋洗磷脂，分離得到混合液中的磷脂，加入1 mL 0.2 mol·L-1的甲醇溶液和1 mL甲醇甲苯混合液，37 ℃水浴加熱15 min，使其分解為脂肪酸甲酯(fatty acid methyl ester, FAME)，加入0.1 mL冰醋酸，用正己烷萃取磷酸脂肪酸甲酯，吹干得到脂肪酸甲酯。使用氣相色譜儀測定脂肪酸含量及組成，根據雙鍵位置、碳原子數等確定不同的磷脂脂肪酸。根據特定的磷酸脂肪酸標記物區分細菌、真菌、放線菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌(表1)。

1.5 數據統計分析

利用多因素方差分析(ANOVAs)和最小顯著差異法(LSD)分析不同修復年限和不同土層間土壤微生物生物量、土壤微生物多樣性、土壤養分及pH的差異；利用單因素分析方法(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)分析不同恢復年限植物蓋度變化；顯著水平為P<0.05。分析土壤養分、pH、微生物生物量和微生物群落之間的Pearson相關性，所有數據通過SPSS 20.0計算。

2 結果與分析

2.1 草本不同修復階段植被多樣性變化特征

表1 磷脂脂肪酸的代表生物Table 1 PLFAs biomarkers indicating microbial group

草本恢復過程中，修復第1年，采用人工種植燕麥、垂穗披堿草、中華羊茅3種草本混播，燕麥在人工草本修復2年后消失；且隨著修復期的延長，在植物群落演替過程中，逐漸出現菥蓂(Thlaspiarvense)、藜(Chenopodiumalbum)等一系列旱生草本短命植物，隨后演替出現以禮草(Kengyiliamelanthera)、沙蒿、賴草(Leymussecalinus)等多年旱生植物。草本植被蓋度顯著增加(P<0.05)，地上植被物種數從未治理前的4種，增加至修復第4年的14種；地上植被蓋度從4%增加到80%，是對照的20倍(表2)。

2.2 沙地草本不同修復階段沙地土壤pH及養分變化特征

整體來看，隨著修復年限的增加，0～10 cm和10～20 cm兩土層土壤有機質，全N、全P均出現先減少后增加的變化，且土壤有機質含量在恢復4年后顯著(P<0.05)高于未治理沙地(表3)。其中，在人工修復第1和2年，兩個土層沙地土壤有機質、全N、全P含量發生明顯下降，且顯著低于未修復沙地(P<0.05)，表層土壤有機質變化最明顯；到修復第3年開始顯著增加，修復4年后，兩個土層土壤全N、全P含量均恢復到未修復水平，且有機質含量增加，比未修復沙地高出了55%；但表層土壤pH在修復4年后，顯著降低(P<0.05)。修復年限和土層分別對土壤pH、有機質、全N、全P具有顯著影響(P<0.01)，但不同修復年限與土層相互作用僅顯著影響土壤pH和全P含量(表4) (P<0.05)，對土壤有機質、全N含量影響不顯著。

2.3 草本不同修復階段土壤微生物生物量及多樣性變化特征

以未治理沙地為對照，0～10 cm和10～20 cm根系生長層中，土壤微生物生物量及多樣性隨恢復年限均呈現先降低后增加的趨勢(圖2，表5)，且除修復第1年外，下層微生物生物量始終顯著(P<0.05)低于土壤表層。

表2 不同修復年限草本植被多樣性調查Table 2 The vegetation diversity in different restoration stages of herbs (mean±SD, n=3)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: The different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05).

0～10 cm土層土壤微生物量碳、氮、磷的動態變化趨勢為，修復的第1年，含量低于未修復的水平(P<0.05)；修復2年后，微生物生物量碳、氮、磷持續增加；到修復第3和4年，微生物生物量碳、磷含量升高但差異不顯著，微生物生物量氮含量則顯著高于對照 (P<0.05)(圖2)。10～20 cm土層的微生物生物量碳、磷含量與0～10 cm土層的變化相似；在植被恢復的最初2年內，土壤微生物生物量各組分含量顯著降低(P<0.05)；到修復第3年，微生物生物量碳、氮、磷含量開始增加，且微生物量氮含量顯著高于未修復水平(P<0.05)；但是修復4年后，微生物量氮含量降低，但高于對照。

高寒沙地植被修復樣地中只檢測到了細菌、G+、G-、真菌、放線菌；0～20 cm土壤微生物總量為(8.30±0.99) nmol·g-1，修復4年后增加到(10.58±2.99) nmol·g-1，其中主要類群為細菌，在修復前和修復4年后均各占微生物總量的51% (表5)。以未修復沙地為對照， 隨著修復年限增加， 在0～10 cm和10～20 cm土層，土壤微生物群落呈先減少后增加的趨勢。0～10 cm土層，草本修復第1和2年，沙地細菌含量顯著降低(P<0.05)，沙地中未檢測到革蘭氏陰性菌G-、革蘭氏陽性菌G+、真菌、放線菌含量；修復第3年，微生物類群中各組分含量均恢復到未修復水平；4年后，細菌含量大于未修復水平，但在微生物總量中所占比例與未治理相比卻下降了20%。10～20 cm土層中，草本修復第1年，微生物群落變化與上層土壤一致；2年后，沙地土壤中檢測到少量真菌，其含量顯著低于未修復沙地(P<0.05)。修復第3年，微生物各類菌群含量恢復至未修復水平；草本修復4年后，真菌含量下降，且顯著低于未治理沙地。

表3 不同修復年限和不同土層土壤養分及pH變化Table 3 Soil nutrient and pH changes in different soil layers with different restore years

注：不同小寫字母代表年限之間差異顯著，不同大寫字母代表土層之間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: The different lowercase letters indicate significant differences between restore year. The uppercase letters indicate significant differences between soil layers (P<0.05). The same below.

表4 沙地土壤pH及養分在不同修復年限和土層之間的差異 Table 4 Two-way ANOVA for the effects of soil layer，restore year and their interactions on pH and nutrients

表5 草本不同恢復階段不同土層土壤微生物多樣性變化特征Table 5 Characteristics of soil microbial diversity in different soil layers (mean±SD, n=3) (nmol·g-1)

注：—表示采用PLFAs未檢測到的微生物菌群的相對含量。

Note: — indicate the relative content of microbial functional communities that were not detected by PLFAs.

圖2 植被修復年限下土壤微生物量碳、氮、磷的變化Fig. 2 Changes of soil microbial biomass carbon, nitrogen and phosphorus in two soil layers 不同小寫字母代表年限之間差異顯著，不同大寫字母代表土層之間差異顯著(P<0.05)。The different lowercase letters indicate significant differences between restore year；The uppercase letters indicate significant differences between soil layers (P<0.05).

沙地不同修復年限和不同土層對微生物量碳、微生物量氮、細菌、真菌、放線菌含量變化均具有顯著影響(P<0.05)。修復年限對微生物總量變化具有顯著影響(P<0.05)，但對真菌含量變化影響不顯著，土層因素對微生物生物量(碳、氮、磷)變化具有極顯著影響(P<0.01)，對微生物多樣性(微生物總量、細菌、真菌、G-菌、G+菌)含量變化影響不顯著(表6)。

土壤有機質、全N、全P 含量與微生物生物量和微生物總量及細菌呈極顯著的正相關關系(P<0.01)；pH與有機質、微生物總量、細菌含量極顯著負相關(P<0.01)，與全N、G-菌、G+菌含量變化顯著負相關(P<0.05，表7)。

表6 土層、沙地土壤微生物生物量及多樣性在不同修復年限和土層之間的差異Table 6 Two-way ANOVA for the effects of soil layer, restore year and their interactions on microbial biomass and diversity

3 討論

3.1 沙地草本修復過程中地上植被變化

高寒半濕潤沙化草地植被調查研究發現，隨修復年限的增加，地上植被蓋度顯著增大，物種多樣性顯著增多(P<0.05)；物種數從未修復的4種，增加到修復4年后的14種；沙地修復前主要以賴草、沙蒿、以禮草等多年生耐旱植物為主，而修復初期人工種植草本的介入增加了生態系統中植物個體數量，一年生燕麥作為沙地修復的前期物種，在人工種植2年后消失，這可能是由于草本修復初期，燕麥是一年生植物，生長速率快，在牧草恢復過程中，作為前期物種，涵養土壤水分，維持沙土穩定[30-32]，隨著沙地修復過程中土壤養分、水分等條件的改善，外來入侵物種在生態系統中數量增多，植被蓋度顯著增大(P<0.05)[33]，燕麥和外來沙地適應性物種發生競爭，土壤養分、水分、生態位等條件的有效限制，使燕麥逐漸退出生態系統。這與左小安等[34]在科爾沁沙地研究結果相似。

3.2 土壤養分變化對沙地修復過程的響應

高寒沙地在人工種植草本條件下逐漸恢復，且土壤pH及基礎養分也隨之發生變化。土壤有機質含量在恢復4年后顯著高于未修復沙地，且 0～10 cm土層含量大于深層(10～20 cm) (P<0.05)。沙地修復初期，人為干擾引起沙地土壤理化性質改變，沙地外來入侵物種增多，并且地表開始出現結皮[35]；此外，人工種植草本對土壤養分利用較大，特別是一年生燕麥由于生長周期短，生長速度快，對沙地土壤有機質、礦物質等消耗迅速。修復3至4年后，地表凋落物增多，在微生物的作用下，形成大量腐殖質，土壤中有機質含量與未治理相比升高了55%。齊文娟等[36]在青海省果洛州建植6年的人工草地發現土壤有機質隨建植年限的增加呈現先降低后增加的趨勢，這與本研究結果一致。其原因是沙地修復過程中，高寒沙地由于受到環境及人為因素的影響，在植被恢復過程中，養分循環和積累與系統自我調節過程較為緩慢，因此，沙地養分變化呈現先降低后增加的趨勢。

3.3 沙地修復過程對土壤微生物含量變化的影響

隨著修復年限的增加，兩土層土壤微生物生物量及多樣性均呈現先降低后增加的趨勢。這與楊希智等[37]在青海省的研究結果一致。出現這一現象的原因是：草本種植前，沙地群落物種組成單一，群落結構簡單且較穩定，而在人工草本種植后，沙地修復初期，人工草本和入侵雜草對沙地土壤養分利用加劇，土壤肥力迅速下降，微生物可利用養分、水分等含量減少，使微生物生物量和多樣性顯著降低(P<0.05)；修復3至4年后，隨著燕麥等一年生植物凋亡，沙地草本凋落物歸還土壤表層，微生物可利用的養分增多[38]。微生物群落以細菌為主，出現顯著增加的趨勢，微生物生物量增多(P<0.05)，且表層微生物生物量碳、氮、磷含量顯著高于深層土壤。此外，在修復4年后發現10～20 cm土層真菌含量顯著低于未修復水平，原因可能是沙地恢復時間較短,凋落物主要分布在土壤上層，下層土壤中有機質與礦物質含量較低，導致真菌主要集中于土壤表層[39]。高寒沙化地區草本修復主要受該地區土壤環境的影響，特別是在特殊的降水條件下，草本生長和土壤微生物之間的關系可能受到土壤養分及pH等條件的限制，因此需要考慮降水引起的土壤中有機質、礦物質等含量的變化，更多的研究需要用于對該區域長期土壤環境動態變化的探索。

土壤微生物與土壤養分變化密切相關，地上植被的變化可調控土壤養分的變化，進而影響土壤微生物生物量和多樣性的變化。研究發現通過人工建植草地，在沙地修復后土壤微生物群落顯著增加[37]，且土壤養分影響土壤微生物的變化，較適的土壤養分有利于植物生長和土壤微生物群落繁殖[40]。本研究中，微生物生物量與土壤養分變化差異顯著(P<0.05)，但微生物群落主要以細菌為主，此外，土壤微生物通過提高土壤聚集性間接影響養分循環，從而穩定土壤中有機質及礦物質含量[41]，且由于土壤細菌和真菌兩種微生物獨特的生理特性對土壤理化性質的不同響應，其相對豐度和活性的變化也可能會影響土壤養分的循環和積累，進而引起土壤肥力的變化，但具體機理還需進一步研究。

4 結論

利用人工種植混合草本對高寒沙地進行沙化治理，修復4年后，地上植被蓋度、物種數、土壤有機質含量顯著增大；沙地微生物及土壤養分含量隨修復過程先減少后增加，且微生物主要以細菌為主。微生物量氮在修復4年后顯著高于未修復水平；革蘭氏陰性菌(G-)、革蘭氏陽性菌(G+)、真菌、放線菌在沙地修復第1年顯著降低，修復3年后，沙地中再次檢測到4種微生物菌群，4年后，土壤微生物與土壤全N，全P含量均恢復到未修復水平，且沙地土壤有機質含量顯著增高。在高寒半濕潤沙地進行人工種植草本對沙化草地修復具有促進作用。