氮添加對貝加爾針茅草原土壤細菌群落結構的影響

劉紅梅，楊殿林*，張海芳，趙建寧，王慧，張乃琴

(1.農業農村部環境保護科研監測所，農業農村部產地環境污染防控重點實驗室，天津市農業環境與農產品安全重點實驗室，天津300191；2.德州學院，生態與園林建筑學院，山東 德州253023)

近幾十年來，由于化石燃料燃燒，化肥施用等人類活動，大氣氮沉降呈現急劇增加趨勢[1]，導致了一系列生態環境問題。氮沉降增加會降低植物多樣性[2]、降低微生物生物量碳氮比[3]，改變土壤微生物群落結構[4-5]，影響微生物介導的碳氮循環過程[6]，從而導致生態系統穩定性降低[7]。我國草地面積占全國國土面積的41.7%，在全球碳氮循環和氣候變化響應中發揮重要作用。

氮元素是干旱和半干旱草原土壤微生物生長繁殖的主要限制因子之一[8]。氮沉降增加會緩解草原生產中氮的限制，提高土壤中有效態氮含量，從而增加草原生產力。但過多的氮輸入會增加土壤酸化和硝態氮淋溶的危險，導致生態系統功能退化或喪失。氮沉降或氮添加引起北方溫帶草原地上植物群落組成、多樣性、優勢植物光合特征、葉片功能特性改變[9-10]，影響土壤化學性質和微生物學特性[11]以及增加溫室氣體排放[12-13]。土壤細菌是土壤微生物的重要組成部分，在土壤有機質分解、養分轉化等生態過程中有著不可或缺的地位[14]。土壤細菌群落結構及多樣性變化是表征土壤質量變化的重要指標[15]。因此研究氮沉降增加對土壤細菌群落的影響具有重要意義。一些研究表明氮添加會影響土壤細菌優勢菌群豐度，改變土壤細菌群落結構[16]。另一些研究表明，短期施氮不會對土壤細菌群落產生顯著影響，但高氮處理會顯著改變敏感菌群相對豐度，富營養型細菌豐度增加，而貧營養型類群豐度降低[17-19]。由于氮添加量、氮添加時間和研究對象不同，土壤細菌群落對氮沉降或氮添加響應不同。

貝加爾針茅(Stipabaicalensis)草原是亞洲中部草原區所特有的草原群系，在我國畜牧業生產中占有重要地位。氣候模擬研究表明，中國北方草原氮沉降將會持續增加[20]。本研究以貝加爾針茅草原為研究對象，施氮模擬氮沉降增加，利用Illumina Miseq高通量測序技術，探討不同氮添加水平下土壤細菌多樣性、群落結構組成變化及其與土壤化學性質的關系，為有效應對氮沉降增加并提高草原生態系統功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗區域概況、試驗開始前土壤理化性質及試驗設計見參考文獻[11]。試驗地位于內蒙古自治區貝加爾針茅草原(48°27′-48°35′ N，119°35′-119°41′ E)。海拔760～770 m，年均降水量為328.7 mm，年均氣溫-1.6 ℃。植被類型為貝加爾針茅草甸草原，優勢植物種類主要為貝加爾針茅和羊草(Leymuschinensis)。共有植物66種，分屬21科49屬。土壤類型為暗栗鈣土。

1.2 樣地設置與樣品采集

于2010年6月開始模擬氮沉降的氮添加試驗。設8個外源氮添加處理水平，依次為：對照N0，低氮添加(15、30、50 kg N·hm-2·yr-1)分別記為N15、N30和N50，高氮添加(100、150、200、300 kg N·hm-2·yr-1)分別記為N100、N150、N200和N300。于每年6月中旬和7月中旬分兩次進行氮添加，氮肥為NH4NO3，將其溶于水后均勻噴灑在各小區內。小區面積8 m×8 m，小區間設2 m隔離帶，4次重復，重復間設5 m隔離帶。

于2015年8月中旬采集土壤樣品。按照S型取樣法在每個小區選取10個點，用土鉆取0～10 cm土層土壤樣品混合均勻。去除植物根系、石礫等雜物，裝入無菌封口袋，放入冰盒中帶回實驗室。過2 mm篩后，將其分成兩份，一份于-20 ℃低溫保存，用于DNA提取和土壤速效養分分析，另一份土樣于室內自然風干后，用于土壤化學指標測定。

1.3 土壤化學指標測定

采用玻璃電極法(土水質量比1.0∶2.5)測定土壤pH，采用重鉻酸鉀外加熱法測定土壤總有機碳(organic carbon)，采用凱氏定氮法測定土壤全氮(total nitrogen)，采用鉬銻抗比色法測定土壤全磷(total phosphorus)，采用2 mol·L-1氯化鉀溶液提取-流動分析儀(AA3，德國)測定土壤硝態氮(nitrage nitrogen, NO3--N)和銨態氮(ammonia nitrogen, NH4+-N)，采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測定土壤速效磷(available phosphorus)。上述測定方法參照鮑士旦[21]《土壤農化分析》第三版。

1.4 土壤細菌16S rDNA克隆文庫構建和Illumina測序

采用Power Soil?DNA Isolation Kit試劑盒提取土壤總DNA，提取步驟按試劑盒說明書進行。提取后的土壤總DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用超微量分光光度計(NanoDrop2000，德國)進行質檢。采用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對提取的DNA進行精確定量，以確定PCR反應加入的DNA量。選擇細菌V3～V4區的16S rDNA序列進行PCR擴增。擴增引物序列為336F：5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。使用帶barcode的特異引物，區分個體樣本。PCR擴增體系為：10×Pyrobest Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol·L-1)4 μL，引物F(10 μmol·L-1)2 μL，引物R(10 μmol·L-1)2 μL，Pyrobest DNA Polymerase(2.5 U·μL-1)0.3 μL，DNA模板30 ng，加去離子水到50 μL。反應條件為：95 ℃預變性，5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s進行25個循環；72 ℃延長10 min。擴增反應完成后，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生工瓊脂糖回收試劑盒(cat：SK8131)進行DNA回收。使用Qubit 2.0熒光定量系統測定回收產物濃度，將等摩爾濃度的擴增子匯集到一起，混合均勻后進行測序。測序由北京奧維森基因科技有限公司完成，采用Illumina Miseq測序平臺進行Paired-end高通量測序。每個土壤樣品3個生物學重復。

1.5 數據分析

下機數據經過Trimmomatic、Readfq(vertion 6.0)和Flash(version 1.2.10)軟件預處理，去除低質量reads，然后根據雙末端測序讀長(PE reads)之間的重疊(overlap)關系將成對的reads拼接成一條序列。去除tags兩端的barcode序列及引物序列，去除嵌合體及其短序列等后得到高質量的clean tags，拼接過濾后的clean tags，在0.97相似度下利用QIIME軟件將其聚類為用于物種分類的操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)，統計各樣品OTU中的豐度信息。對比GreenGenes數據庫，對每個OTU進行物種注釋。應用QIIME(version 1.7.0)計算樣品的多樣性指標。Alpha多樣性是對單個樣品物種多樣性的分析，基于OTU的結果，計算Chao1指數、觀測值指數(observed species)、譜系多樣性指數(phylogenetic diversity, PD whole tree)和香農指數(Shannon)來進行生物多樣性分析。Observed species、PD whole tree和Chao1指數反映樣品中群落的豐度，其值越大表明群落物種的豐富度越高。Shannon指數表示細菌群落多樣性程度，其值越大，表明群落多樣性越高。采用主成分分析(principal component analysis, PCA)和非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling, NMDS)分析不同氮添加水平處理與對照間細菌群落組成的差異性。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析不同氮添加處理之間的土壤化學性質、細菌豐度和多樣性指數差異，采用Pearson相關性分析土壤細菌多樣性指數、優勢類群與土壤化學因子之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質變化

連續6年不同氮添加處理條件下，土壤化學性質變化見表1。低氮添加(N15、N30和N50)處理下土壤有機碳、硝態氮含量與N0相比無顯著差異(P>0.05)；高氮添加(N150、N200和N300)處理下土壤有機碳含量顯著高于N0；高氮添加(N100、N150、N200和N300)處理下土壤硝態氮和速效磷含量顯著高于N0。N30、N50、N100、N150、N200和N300的土壤pH均顯著低于N0(P<0.05)。N15、N30、N50、N100、N150和N200處理的C/N與N0相比無顯著差異(P>0.05)，N300則顯著高于N0(P<0.05)。土壤全氮含量和N/P在不同氮添加處理間無顯著差異(P>0.05)。

2.2 不同氮添加處理對Alpha多樣性指數的影響

通過Miseq高通量測序共得到有效序列1036564條，質量控制后得到優質序列919775條，每個處理OTU數為18264～27426。不同氮添加處理下土壤細菌Alpha多樣性指數變化見表2。7個氮添加處理的Chao1、Observed species、PD whole tree和Shannon指數與對照相比無顯著差異。N15、N50、N100和N150處理的Chao1和Observed species指數顯著高于N300。

土壤細菌Alpha多樣性與土壤化學因子的相關性分析結果見表3。Observed species與土壤有機碳含量呈顯著負相關關系(P<0.05)。Chao1、Observed species、PD whole tree和Shannon指數均與全氮含量呈極顯著正相關關系(P<0.01)；Chao1與全磷含量呈顯著正相關關系(P<0.05)，Observed species、PD whole tree和Shannon指數與全磷含量呈極顯著正相關關系(P<0.01)。表明影響土壤Alpha多樣性指數的主要土壤環境因子是土壤全氮和全磷含量。

注：同行不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different small letters in the same line mean significant difference at 0.05 level among treatments.

表2 不同氮添加處理條件下土壤細菌群落Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity index of soil bacterial community under different nitrogen addition treatments

注：同列不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different small letters in the same column mean significant difference at 0.05 level among treatments.

2.3 不同氮添加處理土壤細菌群落結構和組成

各個樣品在門分類水平上具有較高的多樣性，在群落中占主導的細菌門類有酸桿菌門(Acidobacteria)(19.01%～38.31%)，變形菌門(Proteobacteria)(6.64%～17.11%)，放線菌門(Actinobacteria)(5.07%～16.06%)，疣微菌門(Verrucomicrobia)(3.57%～7.40%)，綠彎菌門(Chloroflexi)(3.38%～8.42%)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(0.87%～1.81%)(圖1)。N50、N100和N300的酸桿菌門相對豐度顯著低于N0。N30、N50、N100、N150、N200和N300的疣微菌門相對豐度顯著低于N0。N30、N50、N100和N150的芽單胞菌門相對豐度顯著高于N0。7個氮添加處理的綠彎菌門相對豐度均顯著低于N0。

表3 土壤Alpha多樣性指數與土壤化學因子的相關性Table 3 Correlation analysis between soil bacterial Alpha diversity index and soil chemical properties

注：“*”表示顯著相關(P<0.05)，“**”表示極顯著相關(P<0.01)，“-”表示無顯著相關(P≥0.05)。下同。

Note：*indicates correlation is significant at 0.05 level, ** indicates correlation is significant at 0.01 level, “-” indicates no significant correlation. The same below.

圖1 不同氮添加處理下土壤細菌門類相對豐度變化Fig.1 Relative abundances of the dominant bacterial phylum for different nitrogen addition treatments

不同氮添加處理之間有顯著差異的OTUs豐度的PCA如圖2所示，前兩個主成分分別占細菌群落變異的36.97%和12.52%。高氮添加(N150、N200、N300)位于主成分1右側，而N0、N100與低氮添加(N15、N30和N50)位于主成分1左側。說明高氮添加有顯著差異OTUs豐度組成相似，而N0、N15、N30、N50與N100有顯著差異OUTs豐度組成相似。非度量多維尺度分析常用于比較不同樣本組之間的差異，樣品點的分布代表了樣本與樣本之間的相似度程度。基于各氮添加處理差異OTUs豐度的NMDS結果，可以發現7個氮添加處理差異OTUs與對照處理差別顯著，且高氮添加處理與低氮添加、對照和N100處理處于不同排序區(圖3)。表明高氮添加對土壤細菌群落產生了顯著影響。

圖2 不同氮添加處理之間有顯著差異的細菌OTUs豐度的PCA分析 Fig.2 Principal component analysis (PCA) of pyrosequencing bacterial OTUs abundance with significant differences among different nitrogen addition treatments

圖3 基于差異OTUs豐度的NMDS分析Fig.3 Nonmetric multidimensional scaling (NMDS) analysis based on the major different OTUs abundance

2.4 土壤細菌主要類群相對豐度與土壤化學性質的相關性

優勢細菌門和土壤環境因子相關性分析結果見表4。酸桿菌門與氮輸入量和硝態氮含量呈顯著負相關(P<0.05)，與銨態氮含量呈極顯著負相關(P<0.01)，與土壤pH值呈極顯著正相關(P<0.01)。變形菌門與土壤pH和全磷含量呈顯著負相關(P<0.05)。疣微菌門與氮輸入量、有機碳和硝態氮含量呈極顯著負相關(P<0.01)，與土壤C/N呈顯著負相關(P<0.05)，與土壤pH和全磷含量呈極顯著正相關(P<0.01)。綠彎菌門與土壤pH和全磷含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與氮輸入量和硝態氮含量呈極顯著負相關(P<0.01)，與土壤有機碳、速效磷和N/P呈顯著負相關(P<0.05)。土壤pH與酸桿菌門、疣微菌門和綠彎菌門呈極顯著正相關(P<0.01)，與變形菌門呈顯著負相關(P<0.05)(圖4)，說明氮添加通過改變土壤pH而影響了土壤細菌群落結構。

表4 土壤細菌主要類群相對豐度與土壤化學性質的相關性Table 4 Correlation analysis between the relative abundance of soil bacterial groups and soil chemical properties

圖4 土壤細菌主要類群相對豐度與土壤pH的相關性Fig.4 Correlations between soil dominant bacterial phylum and soil pH

3 討論

3.1 土壤細菌多樣性對氮添加響應的綜合分析

多樣性指數是表征土壤微生物群落豐富度和多樣性的重要指標，多樣性指數越高表明土壤微生物群落豐富度和多樣性越高[22]。楊山等[23]對我國北方溫帶典型草原和郝亞群等[17]對中亞熱帶杉木林(Cunninghamialanceolata)氮添加試驗表明，短期氮添加對土壤細菌豐富度指數和多樣性指數未產生顯著影響。本研究表明，隨著氮添加水平的升高，細菌豐富度指數和多樣性指數總體上表現為先升高后降低的趨勢，但與對照相比無顯著差異。連續6年氮添加對細菌Alpha多樣性指數未產生顯著性影響。高氮添加處理(300 kg N·hm-2·yr-1)時土壤細菌Alpha多樣性指數均低于對照，有降低趨勢。Freitag等[24]研究表明，過量無機氮素添加不利于提高草地土壤細菌α多樣性。前人研究認為，低氮添加緩解了細菌生長的氮限制，細菌豐度和種類增加，而高濃度氮添加反而會抑制土壤細菌多樣性[25-26]。本研究結果與這一研究結論一致。這可能是因為本研究模擬氮沉降所用肥料為NH4NO3，NH4+在氧化成亞硝酸鹽過程中釋放出H+，引起土壤酸化，從而使不耐酸細菌物種繁殖緩慢，物種多樣性下降；也有可能是高氮添加導致土壤中可利用性氮素含量增多，導致喜氮微生物生長迅速[27]。本研究中，土壤細菌Alpha多樣性與土壤化學因子的相關性分析結果表明，土壤全氮和全磷含量是影響土壤細菌群落Alpha多樣性重要因素。

3.2 土壤細菌群落結構對氮添加響應的綜合分析

氮素是干旱和半干旱草原生態系統限制因子之一，氮沉降增加會影響土壤微生物生長和繁殖以及細菌豐度和多樣性變化。本研究對細菌群落種群的相對豐度分析表明，隨著氮添加水平的升高，細菌門類相對豐度表現出不同的變化趨勢。高氮添加提高了放線菌門和變形菌門相對豐度，前人研究認為放線菌和變形菌門屬于富營養型細菌，在高氮環境中生長繁殖速度快[25,28]，本研究結果與此一致。酸桿菌門和疣微菌門相對豐度隨著氮添加量增加而降低。其可能原因是其屬于寡營養類群，這類微生物類群具有較低的生長速度和較難降解物質能力。Fierer等[28]研究表明，疣微菌門更適合養分含量較低的土壤條件，這符合微生物氮礦化假說，即在高氮環境中微生物利用較難降解碳源的能力降低[29]。高氮添加處理中，寡營養類群微生物與富營養類群相比有較低的競爭力。氮添加對土壤細菌群落結構的影響與氮添加水平有關。Zeng等[25]對溫帶草原氮添加試驗發現，氮添加大于120 kg N·hm-2·yr-1顯著影響土壤細菌群落結構。本研究中，氮添加大于150 kg N·hm-2·yr-1顯著影響貝加爾針茅草原土壤細菌群落結構。

土壤細菌生長受土壤環境因子的影響[30]，其中土壤酸堿程度對土壤細菌群落的影響最為顯著[31]。本研究優勢菌群與土壤化學性質相關分析表明(表4)，土壤pH值是影響土壤細菌群落的主要因素，這與前人研究一致[25, 32-33]。Wang等[34]在亞熱帶森林氮添加試驗表明，氮添加150 kg N·hm-2·yr-1顯著降低土壤pH，且土壤細菌群落組成與土壤pH呈負相關。前人研究認為，土壤酸化對細菌群落的生態選擇和不同細菌群落在酸性條件下壓力下的適應性進化，是土壤酸化導致土壤細菌群落改變的機制[35]。疣微菌門在高氮添加處理中具有較低相對豐度，且該類群相對豐度與土壤有機碳、硝態氮和C/N呈顯著負相關。土壤硝態氮含量與酸桿菌門、疣微菌門和綠彎菌門呈顯著負相關。土壤銨態氮含量與放線菌門、芽單胞菌門和酸桿菌門均有顯著相關性。推測在本研究區細菌優勢菌群的相對豐度變化也受到了養分有效性的驅動。Yang等[36]研究也表明土壤化學性質包括土壤pH、無機氮含量等是影響土壤細菌群落結構的土壤環境因素。原因可能是氮添加導致草地植物群落組成發生變化[9]，而植物凋落物分解和根系分泌物影響土壤細菌生長條件，如土壤pH、容重、速效氮、可溶性碳等土壤理化因子不同，導致土壤細菌可獲取的營養物質和所處的環境不同，土壤中適宜生長的細菌群落也不同。

4 結論

1)連續6年氮添加未顯著改變貝加爾針茅草原土壤細菌Alpha多樣性。土壤全氮和全磷含量是影響土壤細菌群落Alpha多樣性的重要因素。

2)細菌群落結構與組成受氮添加水平的影響。15～100 kg N·hm-2·yr-1氮添加未顯著改變貝加爾針茅草原土壤細菌群落結構，150 kg N·hm-2·yr-1以上氮添加顯著改變土壤細菌群落結構。