豌豆與根瘤共生對水分脅迫的生理響應

馬蕾，馬紹英，陳貴平，柴強*，李勝

(1.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州730070；3.甘肅農業大學基礎教學實驗中心，甘肅 蘭州730070；4.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070)

豌豆(Pisumsativum)作為一種糧、菜、飼、肥兼用作物[1]，因其有廣泛的用途、豐富的營養和較高的經濟價值，受到生產者和消費者的喜愛。近年來由于干旱問題的日趨嚴重，導致水分匱缺成為限制豌豆產量、質量和種植效益的主要逆境因子[2]。因此，在水資源嚴重匱乏的環境壓力下，研究豌豆的抗旱性具有重要的應用價值。

根瘤菌(Rhizobium)可與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮氣供植物營養的一類桿狀細菌。這種共生體系具有較強的固氮能力，同時根瘤菌自身的抗旱性可以改善干旱地區的植被狀況及提高其農業生產能力。據報道，部分在豆科植物上結瘤的根瘤菌，如大豆(Glycinemax)根瘤菌、豌豆根瘤菌等對高滲透環境均較敏感，而在逆境條件下分布的根瘤菌菌株卻表現出與環境良好的適應性[3]。因此，探索豆科植物與根瘤菌共生對逆境的適應性有很大的意義。

研究表明，植物的抗旱性主要表現在滲透調節物質的積累、膜脂成分的變化、自由基的清除作用、蛋白的誘導形成和激素調節等綜合因素作用的結果[4]。水分脅迫會引起超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、脯氨酸(proline, Pro)、可溶性糖和丙二醛(malondialdehyde, MDA)等生理生化指標的變化。鄭世英等[5]研究得出，小麥(Triticumaestivum)在水分脅迫下SOD活性先升高后降低。顧建勤等[6]認為，豌豆在干旱脅迫下POD和CAT活性明顯升高，且隨脅迫程度的加重和時間的延長增幅加大。張永杰等[7]和趙振寧等[8]研究表明，小麥和大豆在干旱脅迫下滲透調節物質Pro和可溶性糖含量明顯增加。季楊等[9]研究發現，鴨茅(Dactylisglomerate)由于干旱脅迫造成植物體內大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的積累，導致膜脂過氧化水平增高，MDA含量增加，使細胞膜結構被破壞，從而損害植物的生長。張攀等[10]得出，苜蓿(Medicagosativa)與根瘤共生后，在逆境脅迫條件下，SOD、POD、CAT、Pro、可溶性糖含量顯著高于不接菌處理，而MDA含量低于不接菌處理。李莎莎等[11]認為，根瘤菌共生紫花苜蓿在逆境下具有更強的膜穩定性、活性氧干旱防御以及滲透調節能力，對環境適應性更強。目前根瘤菌共生在提高苜蓿抗逆性的研究中報道較多，但對豌豆根瘤菌共生提高抗逆性的報道尚少，為了更好地了解根瘤菌在共生條件下對豌豆抗旱性的效應，本試驗研究了不接種根瘤菌和根瘤共生的豌豆在水分脅迫下地上部和地下部SOD、POD、CAT、Pro、MDA、可溶性糖等活性及含量變化，以期初步闡明豌豆植株與根瘤菌共生對水分脅迫的生理響應機制，為豌豆的抗旱栽培提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以定西市農業科學院提供的抗旱品種定豌8號和甘肅省農業科學院提供的非抗旱品種隴豌6號為供試植物材料；以甘肅農業大學草業學院提供的苜蓿根瘤菌Da99菌株和中國微生物菌種保藏中心提供的豌豆根瘤菌15735菌株為供試菌株。

1.2 試驗方法

試驗于2018年4月2日播種，播種前用無菌水浸泡兩種豌豆種子5 h，并在光照培養箱中培養至發芽。對發芽的豌豆種子篩選后進行菌液的浸泡接種，同時以無菌水浸泡的豌豆種子作對照。播種于高35 cm，內徑30 cm的試驗用盆中，供試土壤取自黃土高原半干旱區的定西市安定區鳳翔鎮景家店村，上茬種植作物為小麥，土壤為黃綿土，過篩(0.85 mm)后自然風干，每盆裝9.5 kg。試驗每個處理3次重復，每盆盆栽等距離播種25粒種子，深度3～5 cm，適量澆水，使土壤含水量達到田間持水量的75%，保持至出苗。待苗高達6～7 cm時開始水分脅迫處理。

水分脅迫時期為從苗期至結莢期，脅迫程度分輕度脅迫(田間持水量的55%)和重度脅迫(田間持水量的35%)，并以充分供水(田間持水量的75%)為對照。水分控制用稱重法，每兩天稱重一次。每次稱重后的試驗盆隨機擺放，減小邊際效應。

水分脅迫處理20 d后，取一次鮮樣，為苗期測定材料。根據測定項目，取樣時從每個處理中隨機選取6株植株用于各指標的測定。將豌豆植株取出，根部用水沖洗干凈，在根莖分界點剪開，分離地上與地下部分并用液氮速凍后于-80 ℃低溫冰箱中保存待測。花期和結莢期以同樣的方法各采樣一次。

1.3 測定項目與方法

1.3.1生理指標 采用磺基水楊法測定脯氨酸(Pro)含量[12]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[12]；采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[12]；采用氮藍四唑還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性[12]；采用鉬酸銨比色法測定過氧化氫酶(CAT)活性[12]；采用愈創木酚法測定過氧化物酶(POD)活性[12]。

1.3.2抗旱性評價方法 應用模糊數學中的隸屬函數值法，以6個生理指標進行綜合評價，隸屬函數值計算公式：

R(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

R(X)=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中：X為指標測定值，Xmin、Xmax分別為2個豌豆品種所測某一指標的最小值和最大值。如果該指標與抗旱性呈正相關，則采用(1)式計算隸屬值，如果相反，則用(2)式計算。將抗旱隸屬函數值進行累加，并求得平均值，平均值越大，抗旱性越強[13]。

1.4 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行數據的統計分析。

2 結果與分析

2.1 SOD活性的變化

作物遇到干旱脫水時，產生大量的O2-，對植物細胞產生傷害。SOD是植物體內消除傷害O2-的保護性酶[14-15]。在脅迫條件下，根瘤共生豌豆植株中SOD活性高于不接種根瘤菌的豌豆，其中在輕度水分脅迫下根瘤共生豌豆中SOD活性顯著高于不接菌處理(P<0.05)(表1和表2)。

各生育期不接菌處理的豌豆植株中SOD活性隨著水分脅迫程度地增加而降低，根瘤共生的豌豆植株中SOD活性則隨著水分脅迫程度地增加呈現先上升后下降的趨勢。同時，不同菌對豌豆SOD活性的影響程度不同，在脅迫條件下，接種15735菌的兩個豌豆植株中SOD活性均高于接種Da99菌處理。其中在重度脅迫下，各生育期的地上部分接種15735菌的定豌8號的SOD活性較不接菌處理分別增加了29.96%、49.52%、94.57%，接種Da99菌的SOD活性較不接菌分別增加了7.76%、4.97%、18.65%，相同條件下，接種15735菌的隴豌6號的SOD活性較不接菌分別增加了20.19%、46.56%、81.31%，接種Da99菌的SOD活性較不接菌分別增加了14.13%、42.11%、3.55%。

2.2 CAT活性的變化

植物在干旱脅迫下，體內H2O2發生累積使細胞膜遭受損害，從而加速細胞的衰老和解體，而CAT可以清除H2O2，是植物體內重要的酶促防御系統之一[16]。脅迫條件下，根瘤共生豌豆植株中CAT活性顯著高于不接種處理(P<0.05)，隨著水分脅迫程度地增加不接種根瘤菌的定豌8號植株中CAT活性呈現先升高后降低的趨勢，而相同處理的隴豌6號則隨水分脅迫程度地增加而降低(表3和表4)。根瘤共生的兩種豌豆植株中CAT活性均隨著水分脅迫程度地增加而增加，地上部和地下部變化規律相似。同時，不同菌對豌豆CAT活性的影響程度也有差異，在重度脅迫條件下，接種15735菌的豌豆植株中CAT活性高于接種Da99菌處理。

表1 水分脅迫下定豌8號地上、地下部分SOD活性的變化Table 1 Changes of SOD activity in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (U·g-1 FW)

注：以同一時期的無菌和接菌處理為一組進行顯著性分析，同一時期所有處理的不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下同。

Note: The significance of aseptic and bacteria-treated in the same period was analyzed in a group, the different lowercase letters of all treatments at the same period indicate significant differences at 0.05 level. The same below.

表3 水分脅迫下定豌8號地上、地下部分CAT活性的變化Table 3 Changes of CAT activity in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (U·g-1 FW·min-1)

2.3 POD活性的變化

植物受到干旱脅迫時，細胞內會積累大量的ROS。在ROS代謝過程中，POD發揮著重要作用。POD可催化H2O2分解為H2O和O2，是細胞內重要的清除劑[17-18]。水分脅迫下，根瘤共生的豌豆植株POD活性隨著水分脅迫程度地增加而增加，除隴豌6號地上部苗期，不接菌的豌豆植株隨脅迫程度地增加呈現先升高后降低的趨勢(表5和表6)。在重度脅迫下，根瘤共生的豌豆植株中POD活性顯著高于不接菌處理(P<0.05)。接種不同菌對植株的POD活性影響存在差異，接種15735菌的豌豆植株中POD活性高于接種Da99菌處理，且在重度脅迫下差異顯著(P<0.05)。同時接種同種菌對不同豌豆POD活性的影響不同，其中在重度脅迫下，地上部的各生育期接種15735菌的定豌8號中POD活性較不接菌處理分別增加了72.58%、48.25%、28.79%，隴豌6號較不接菌處理分別增加了58.51%、23.51%、39.13%，接種Da99菌的定豌8號較不接菌處理分別增加了20.84%，23.38%、14.69%，隴豌6號較不接菌分別增加了31.98%、15.20%、19.34%。

表5 水分脅迫下定豌8號地上、地下部分POD活性的變化Table 5 Changes of POD activity in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (U·min-1·g-1 FW)

2.4 脯氨酸含量的變化

Pro是植物對逆境反應敏感的一種重要的滲透調節物質，一般情況下，Pro隨著干旱脅迫程度地增加而大量積累，Pro的含量與植物的抗旱性成正比，是反應植株抗旱性強弱的重要指標[19]。根瘤共生豌豆植株和不接菌的定豌8號植株Pro的含量均隨水分脅迫程度和時間的延長而增加，而隴豌6號在不接菌的處理下呈現先增加后降低的趨勢(表7和表8)。接種根瘤菌處理的豌豆中Pro含量均高于不接菌處理的豌豆，且在重度脅迫下差異顯著(P<0.05)。同時除定豌8號地下部苗期和花期的輕度脅迫外，其余脅迫條件下，接種15735菌的豌豆植株中Pro含量均高于接種Da99菌的處理。其中在重度脅迫下，地上部接種15735菌的定豌8號從苗期至結莢期Pro含量的變化分別較不接菌的處理和接種Da99菌處理的定豌8號高212.17%、38.01%，接種15735菌的隴豌6號從苗期至結莢期Pro含量的變化較不接菌處理的隴豌6號高111.82%。表明定豌8號能積累更多的Pro以適應干旱脅迫，同時接種根瘤菌Da99和15735均能提高豌豆的Pro含量，但兩種菌種間存在顯著差異(P<0.05)。

表6 水分脅迫下隴豌6號地上、地下部分POD活性的變化Table 6 Changes of POD activity in the aboveground and underground parts of Long wan 6 under water stress (U·min-1·g-1 FW)

表7 水分脅迫下定豌8號地上、地下部分脯氨酸含量的變化Table 7 Changes of proline content in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (μg·g-1 FW)

表8 水分脅迫下隴豌6號地上、地下部分脯氨酸含量的變化Table 8 Changes of proline content in the aboveground and underground parts of Long wan 6 under water stress (μg·g-1 FW)

2.5 可溶性糖含量的變化

可溶性糖是植物應對水分脅迫的主要滲透調節物質，維持滲透平衡，使植物抵御干旱引起的傷害，維持植株的正常代謝[20]。如表9和表10所示，可溶性糖含量因豌豆品種的不同而呈現不同的變化趨勢。其中定豌8號地上部和地下部可溶性糖含量均隨水分脅迫程度地增加而增加，接種15735菌的定豌8號在水分脅迫下可溶性糖含量顯著高于不接種根瘤菌的處理(P<0.05)。在輕度和重度脅迫下，接種15735菌的定豌8號中可溶性糖含量顯著高于接種Da99菌處理(P<0.05)。其中在地上部的結莢期，接種15735菌的定豌8號中可溶性糖含量最高，是相同條件下接種Da99菌處理的1.24倍。除苗期不接菌處理，隴豌6號的地上部和地下部在不接菌和接種Da99菌的處理下可溶性糖的含量均隨水分脅迫程度地增加而呈現先上升后下降的趨勢，而在接種15735菌的處理下可溶性糖的含量隨水分脅迫程度地增加而增加。其中在重度脅迫下，接種15735菌的隴豌6號中可溶性糖含量顯著高于接種Da99菌處理(P<0.05)。

2.6 MDA含量的變化

MDA含量的高低是反應細胞膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度的重要指標[19]。豌豆植株中MDA含量隨水分脅迫程度地增加而增加。接種根瘤菌的豌豆中MDA含量低于不接菌處理，其中在脅迫條件下接種15735菌的豌豆植株中MDA含量低于接種Da99菌處理(表11和表12)。同時在輕度和重度脅迫條件下，兩個品種均是地上部MDA含量高于地下部，不同菌株對兩個豌豆品種在受到水分脅迫后MDA含量變化的影響也存在差異，在重度脅迫下，接種15735菌的定豌8號地上部從苗期至結莢期MDA含量較不接菌處理分別降低了10.04%、35.64%、29.83%，接種Da99菌的MDA含量較不接菌分別降低了2.62%、25.25%、18.56%，同時隴豌6號接種15735菌的MDA含量較不接菌分別降低了9.20%、13.35%、13.33%，接種Da99菌的MDA含量較不接菌分別降低了0.55%、7.33%、8.96%。說明根瘤共生可降低豌豆植株在水分脅迫下MDA的含量以減少對細胞膜的損傷。同時接種15735菌較Da99菌更能降低細胞膜脂質過氧化作用對細胞膜的損害，且與定豌8號更匹配。

表9 水分脅迫下定豌8號地上、地下部分可溶性糖含量的變化 Table 9 Changes of soluble sugar content in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (mg·g-1)

表10 水分脅迫下隴豌6號地上、地下部分可溶性糖含量的變化Table 10 Changes of soluble sugar content in the aboveground and underground parts of Long wan 6 under water stress (mg·g-1)

表11 水分脅迫下定豌8號地上、地下部分MDA含量的變化Table 11 Changes of MDA content in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (μmol·g-1)

表12 水分脅迫下隴豌6號地上、地下部分MDA含量的變化Table 12 Changes of MDA content in the aboveground and underground parts of Long wan 6 under water stress (μmol·g-1)

2.7 水分脅迫下不同菌種對兩種豌豆品種綜合生理指標效應的隸屬函數分析

以SOD、CAT、POD、Pro、可溶性糖、MDA 6個抗旱性相關指標為依據，計算各個指標的平均隸屬函數值，并進行抗旱能力綜合評價。在充分供水和脅迫條件下，接種15735菌的定豌8號隸屬平均值均最高，其次為接種15735菌的隴豌6號(表13～15)。在充分供水和輕度脅迫條件下接種Da99菌的隴豌6號隸屬平均值高于定豌8號，但在重度脅迫下，定豌8號的隸屬平均值高于隴豌6號。隸屬平均值越大抗旱性越強，說明接種15735菌較Da99菌更能提高豌豆的抗旱性，同時與定豌8號的匹配性更好。

表13 充分供水條件下不同菌種對兩個豌豆品種綜合生理指標的平均隸屬函數值Table 13 Average subordinate function values of different strains for two pea varieties under adequate water supply condition

表14 輕度脅迫條件下不同菌種對兩種豌豆品種綜合生理指標的平均隸屬函數值Table 14 Average subordinate function values of different strains for two pea varieties under mild water stress condition

表15 重度脅迫條件下不同菌種對兩種豌豆品種綜合生理指標的平均隸屬函數值Table 15 Average subordinate function values of different strains for two pea varieties under severe water stress condition

3 討論

ROS是對植物有害的一類氧自由基，是植物在正常條件下細胞氧化產生的副產物[21-22]，當植物受到干旱脅迫時體內ROS急劇增多，高濃度的ROS會對細胞膜系統造成傷害[23]。植物防御系統中存在一個專門清除和修復ROS的系統，包括多種清除ROS中間體的酶類，如SOD、CAT、POD等，SOD能催化清除超氧自由基，并將其轉化為H2O2，CAT和POD則催化清除植物體內多余的H2O2，保護膜系統免受ROS傷害[11]。滲透調節是植物抗旱的一種重要生理機制，與植物抗旱性密切相關[24-25]。當植物受到水分脅迫時，通過Pro、可溶性糖等滲透調節物質的積累來提高滲透壓，維持植物正常的生長代謝[10]。MDA是植物細胞膜過氧化的產物，其含量的高低經常作為判斷膜脂過氧化傷害程度的重要指標[26]。接種根瘤后豆科植物提供根瘤菌所需養分，同時根瘤菌可以固定大氣中的氮素供給豆科植物。根瘤菌在生長發育中向土壤中釋放一定的有機態氮，加之，根瘤在植物衰老死亡后脫落解體，釋放有機質，從而大大提高了土壤的肥力，改善植株生長狀況，提高植株的抗旱性。本研究發現豌豆接種根瘤菌后，在水分脅迫的環境下，根瘤菌通過與豌豆植株的共生系統來調控植株的生長和生理應答機制來降低水分脅迫的危害。在水分脅迫下，接種根瘤菌的豌豆植株中SOD，CAT，POD與不接菌相比均有增加，但3種酶的變化趨勢有所差異。其中接種根瘤菌的豌豆植株中SOD活性從輕度到重度出現下降，可能是由于SOD作為一種誘導酶，在輕度水分脅迫下，植物體產生較多的超氧陰離子，誘導SOD基因表達，所以SOD活性增加，而在重度水分脅迫下，植物體內代謝紊亂，SOD基因表達受阻，SOD活性下降[23]。根瘤共生的豌豆在受到水分脅迫時體內的Pro和可溶性糖含量均高于不接菌處理，而MDA含量與不接菌相比均有所下降，這與張攀等[10]在紫花苜蓿上的研究結果一致。說明接種根瘤菌可以提高豌豆抵御ROS傷害、增強滲透調節能力，減少膜脂過氧化作用對細胞膜的損害，從而提高豌豆的抗旱性，而且不同菌株對不同豌豆的生理調節能力不同，這可能與豌豆品種、根瘤菌自身以及根瘤菌與豌豆植株形成的共生體系的抗旱性發生變化有關。

植物的抗旱性是一個復雜的性狀，受到多種生理因素的影響，單一的指標變化很難確定和比較植株整體的抗旱性。運用模糊數學中的隸屬函數法對各個指標進行綜合分析后發現，在充分供水以及不同的水分脅迫條件下，接種根瘤菌對植株的生理變化均產生一定的影響，且不同根瘤菌對同一品種的豌豆接種效果不同，同一根瘤菌對不同品種的豌豆接種效果也不同，說明接種根瘤菌對豌豆的抗旱性影響較大。尤其是接種15735菌的兩種豌豆，隨著水分脅迫程度的增加，隸屬平均值均增加，且在定豌8號的重度脅迫下達到最大，其抗旱性最強，這可能與根瘤菌自身的抗旱基因以及在豌豆共生過程中該基因的表達有關，而根瘤菌與豆科植物共生的具體作用機制還有待進一步深入研究。

4 結論

豌豆與根瘤共生對水分脅迫的響應可以通過細胞內多種生理指標的變化來表征。接種根瘤菌能顯著提高豌豆抗旱性，且存在明顯的菌種和豌豆基因之間的差異。本研究采用模糊數學中的隸屬函數法，綜合6個指標對水分脅迫下接種根瘤菌對豌豆抗旱性影響進行分析，發現接種15735菌處理的豌豆抗旱性顯著優于接種Da99菌處理，其中接種15735菌的定豌8號抗旱性更強，說明根瘤菌與豌豆越匹配其抗性也越強。