外源纖維素酶對發酵全混合日糧營養價值、發酵品質和酶活性的動態影響

陳光吉,吳佳海*,尚以順,張蓉,何廷章,吳彥,婁芬,熊俊,甘小波,陳蔭瓊,王普昶,韓永芬，李世歌,舒建虹

(1.貴州省農業科學院草業研究所，貴州 貴陽 550006；2.綏陽縣枧壩鎮農業服務中心，貴州 綏陽 563307；3.綏陽縣草地工作站，貴州 綏陽 563300；4.大方縣農業農村局，貴州 大方 551600；5.貴州金農富平生態農牧科技有限公司，貴州 貴陽 550006)

飼草作為反芻動物日糧中最重要的營養物質和能量來源，其干物質中細胞壁比例達40%～65%，在日糧的組成比例達60%～80%，瘤胃微生物可以產生催化水解這些碳水化合物的酶，但其細胞壁中纖維類物質復雜而致密的網狀結構限制了反芻動物對它們的消化和利用[1]。研究表明，外源纖維素酶(exogenous fibrolytic enzymes，EFE)添加到日糧中是提高反芻動物纖維利用率的有效途徑之一[2-5]，這為提高反芻動物纖維利用率，減少“耗糧型”日糧的應用，緩解“人畜爭糧”矛盾提供了新的途徑[6]。

發酵全混合日糧(fermentation total mixed ration，FTMR)是指根據不同類群或生理階段反芻動物的營養需要，按設計比例，將青貯、干草等粗飼料切割成一定長度，并和精飼料及各種礦物質、維生素等添加劑進行充分攪拌混合后，裝入發酵袋內抽真空或其他方式，創造一個厭氧的發酵環境，經過乳酸發酵的過程，最終調制成的一種營養相對平衡的日糧，其貯存原理與常規青貯飼料類似，即利用乳酸菌發酵后降低飼料pH值，抑制霉菌生長的原理，達到長期保存的目的。與常規的全混合日糧(total mixed ration，TMR)相比，FTMR對反芻動物具有更高的干物質攝入量和瘤胃養分消化率[7]、有效避免長途運輸易耗氧腐敗[8]和家畜挑食[9]等優勢。日本早在20世紀90年代就開發了FTMR技術，而該項技術在我國起步較晚，由于市場需求、配套設備和技術標準等因素，目前僅在北京和上海等大型的奶牛日糧配送中心有所應用，未能得到大范圍推廣。就日糧配方技術而言，目前的研究主要集中在各地區農副產品[馬鈴薯(Solanumtuberosum)渣、醬油渣、豆腐渣、果渣等]的發酵品質與有氧穩定性研究和飼草類型替代效應研究[10-11]，以及乳酸菌劑[12]、糖蜜、乙酸[13]等添加劑的應用研究，其中大部分添加劑旨在解決前期乳酸菌數量不足導致的養分損失、物料糖分不足導致的發酵失敗和有氧條件下的質量穩定性問題。近年來，提高青貯物料自身纖維類物質降解率進而改善發酵品質和營養價值成為青貯添加劑研究的熱點之一。這種途徑主要圍繞木聚糖酶、葡聚糖酶、果膠酶和纖維素酶等非淀粉多糖酶類對青貯物料結構性碳水化合物的降解作用展開，目前主要集中在桑樹(Morusalba)青貯[14]、“菌草”青貯[15]和秸稈微貯[16]等單一粗料青貯，且大多表現出對纖維類物質降解的正效應。

然而，針對FTMR的營養成分特性，需要回答關于FTMR中可溶性糖類和緩沖物質含量較高或比例不恰當是否會影響EFE正常酶促反應的問題。為探究這個問題，本試驗擬通過研究纖維素酶添加到FTMR中，觀察其不同時間點營養價值、發酵品質和酶活性動態變化規律，找出適宜的添加量，為纖維素酶在FTMR中的合理應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

日糧原料由粗料和精料組成，粗料為第2茬初花期的紫花苜蓿(Medicagosativa)干草和刈割高度為1.8 m的皇草(Pennisetumsinese)；精料由玉米(Zeamays)、豆粕、干酒糟及其可溶物(distillers dried grains with solubles, DDGS)、碳酸鈣、磷酸氫鈣、外源纖維素酶、維生素和微量元素預混料等組成。EFE為纖維素酶和木聚糖酶的復合粉劑，購自湖南尤特爾生化有限公司。試驗前，參照Colombatto等[17]的方法測定了外源酶的纖維素酶和木聚糖酶活力：在pH為5.5和39 ℃條件下，纖維素酶和木聚糖酶活力分別為7864.26和3918.47 IU·g-1。

1.2 試驗設計

按照《中國肉牛飼養標準》[18]中列出的體重為300 kg，日增重為1 kg的肉牛營養需要的1.1倍營養水平(干物質采食量為7.11 kg·d-1，粗蛋白質攝入量為785 g·d-1)配制基礎日糧，按照完全隨機試驗設計，并根據課題組前期在纖維素酶應用方面的研究基礎[19]，設置5個纖維素酶添加水平(0、0.4、0.8、1.6、3.2 g·kg-1DM，分別為對照組、EFE+0.4、EFE+0.8、EFE+1.6和EFE+3.2組)，分別在發酵7、14、35、49、70 d采集各處理樣品進行測定，每個處理的每個時間點分別設置3個重復，日糧配方見表1。

1.3 FTMR制備

2017年8月在貴州省畢節市大方縣貴州鴻嘉農牧發展有限公司進行FTMR的制備，實驗室分析在貴州省農業科學院草業研究所牧草生物工程實驗室進行。預先將EFE添加至精料中按照配方分別單獨配制，然后將兩種粗料揉切至2 cm左右，按照設計比例(EFE添加量由低到高的順序進行配制)將精料和粗料投入TMR攪拌機(品牌：銀河，型號：TMR5)中均勻混合15 min，每個處理總量為500 kg。攪拌完畢后，運用“四分法”取600 g制作好的TMR料裝入真空保鮮袋中(長×寬：30 cm×15 cm)，用真空機(品牌：美吉斯，型號：MS1160)抽完袋中空氣(真空袋不再向內側塌陷為止)，袋子外貼上標有處理名稱等內容的標簽，室溫貯存待測。

1.4 樣品采集和指標測定

貯存后第7、14、35、49、70天開包，按照“四分法”每個處理組采集3份樣品(1份400 g，2份100 g)：1份400 g樣品于65 ℃烘箱中制成風干樣，粉碎過40目篩(0.425 mm)，用于常規養分和可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)含量的測定；2份100 g于-20 ℃保存，待測發酵參數指標和酶活性。

常規養分：參照張麗英[20]的方法測定干物質(dry matter, DM)、粗蛋白質(crud protein, CP)、粗脂肪(ether extract, EE)、粗灰分(crude ash, Ash)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)含量；參考Wang等[21]的方法測定WSC含量；采用PHB-5型便攜式pH計(杭州天威工貿有限公司)測定發酵參數中的pH值，采用比色法測定NH3-N含量[22]， 二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid，DNS)法測定纖維素酶和木聚糖酶活性(纖維素酶或木聚糖酶活力定義為39 ℃、pH為6.5條件下，在1 min內水解纖維類物質產生相當于1 μg葡萄糖或木糖的酶量，為1個酶活力單位)[23];參考楊智明等[24]測定羧基肽酶和酸性蛋白酶活性[羧基肽酶活力定義為40 ℃、pH為6.5條件下，每kg底物干物質每min釋放的游離氨基酸量(μmol)，酸性蛋白酶活性定義為在40 ℃、pH 3.0條件下，每kg底物干物質每min水解酪蛋白產生酪氨酸的量(μg)];液相色譜法測定乳酸和揮發性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)含量[25](使用的儀器和色譜條件根據條件摸索結果略作調整)，色譜儀器和條件如下：儀器為LC-20A型液相色譜儀[配InertSustainC18(5 μm×4.6 mm×250 nm色譜柱，日本島津公司]，采用外標法進行分析，乙酸、丙酸和丁酸(色譜純)均購于上海Sigma公司。色譜條件：載氣為氦氣，流量為2 mL·min-1，分流比為10∶1。采用程序升溫，初始溫度為120 ℃，以8 ℃·min-1升溫至180 ℃，保持5 min。進樣口溫度為210 ℃，進樣量為1 μL。

表1 各處理組日糧配方與營養成分(1)Table 1 Ingredients and nutrient composition of each treatment group(1) (%)

注：(1)為原料組成為新鮮基礎，營養成分為干物質基礎；(2)為每kg FTMR干物質提供10 mg Cu，50 mg Fe，20 mg Mn，30 mg Zn，0.10 mg Se，0.50 mg I， 0.10 mg Co；(3)為每kg FTMR干物質提供VA 1500 IU， VD 550 IU， VE 10 IU；(4)各處理組日糧營養成分均為實測值。

Note: (1) Ingredient composition with fresh basis and nutrient composition with DM basis; (2) Provided per kg of FTMR: Cu (as copper sulphate)10mg, Fe (as ferrous sulfate) 50 mg, Mn (as manganese sulfate) 20 mg，Zn (as zinc sulfate) 30 mg，Se (as sodium selenite) 0.10 mg, I (as potassium iodide) 0.50 mg，Co (cobalt chloride) 0.10 mg; (3) Provided per kilogram of FTMR : VA 1500 IU, VD 550 IU, VE 10 IU; (4) The nutritional components of each treatment group were measured.

1.5 數據處理

用SPSS 18.0統計軟件中的一般線性模型(general linear model, GLM)按照單因子完全隨機試驗設計進行方差分析，主效應分別為EFE添加水平和發酵時間梯度，用Duncan 法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.10表示有差異顯著的趨勢。結果用平均值表示，各處理間變異度用平均值的標準誤(standard error mistake, SEM)表示。

2 結果與分析

2.1 概略養分和WSC動態變化規律

縱向看，各處理的DM、CP和WSC含量隨發酵時間的延長呈顯著下降趨勢(P<0.05)(表2)。其中，發酵的第14、35和70天的DM含量以對照組最高(P<0.05)； 橫向看，EFE+0.8和EFE+1.6組的CP含量在發酵的第49天顯著高于對照組(P<0.05)； 除發酵第0天外，ADF、NDF和WSC含量在其他發酵時間點均以對照組最高(P<0.05)，且ADF和NDF含量隨酶添加量的提高均存在先下降后上升的趨勢，其中EFE+0.8組的ADF含量最低，NDF含量從數值上以EFE+0.4組最低，但與多數EFE添加組差異不顯著(P>0.05)，各時間點WSC含量以對照組最低。

表2 EFE對FTMR 概略養分和WSC含量的動態影響Table 2 Dynamic effects of EFE on FTMR general nutrient and WSC content (%)

注：同行相同小寫字母表示組間均值差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列相同大寫字母表示組間均值差異不顯著(P>0.05)，不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: No significant difference with same lowercase letters of the shoulder mark in the mean value between test-groups (P>0.05), and significant difference with different letters (P<0.05); No significant difference with same capital letters of the shoulder mark in the mean value between time-groups (P>0.05), and significant difference with different capital letters (P<0.05). The same below.

表3 EFE對FTMR發酵參數的動態影響Table 3 Dynamic effects of EFE on FTMR fermentation parameters

2.2 發酵參數動態變化規律

縱向看，隨著發酵時間的推移，各處理組pH值均呈現顯著下降的趨勢(P<0.05)；相反，氨態氮、乙酸、丙酸和乳酸含量呈整體上升的趨勢(P<0.05)，而丁酸含量呈現先下降后上升的趨勢(P<0.05)(表3)。橫向看，除發酵的第7天，各處理組pH值在其余發酵時間點差異顯著(P<0.05)或有差異顯著的趨勢(P<0.10)，且均存在隨酶添加量的提高有先下降后上升的趨勢，數值上最低點多出現在EFE+0.8組；試驗因子對各處理在不同發酵時間點的氨態氮含量有顯著影響(P<0.05)，且隨EFE添加量的提高有先下降后上升的趨勢，數值上最低點出現在EFE+0.8組；相反，乙酸和乳酸含量則隨酶添加量的提高呈現先上升后下降的趨勢，最高點多出現在EFE+0.8組或EFE+1.6組；丙酸含量僅在發酵第70天有顯著差異(P<0.05)，以EFE+0.8組最低；各處理在各發酵時間點的丁酸含量無顯著差異(P>0.10)。

2.3 酶活力動態變化規律

縱向上各處理組纖維素酶、木聚糖酶、羧基肽酶和酸性蛋白酶活力均隨發酵時間的推移呈現明顯的下降趨勢(P<0.05)，其中纖維素酶和木聚糖酶活力以對照組下降幅度較大；橫向看，試驗因子顯著影響各處理組的酶活力(P<0.05)(表4)；總體規律：隨著EFE從0添加量提高到0.8 g·kg-1DM，纖維素酶和木聚糖酶活力多在各發酵時間點呈現上升趨勢，但提高到1.6 g·kg-1DM 添加量時則多呈下降趨勢，1.6 ～3.2 g·kg-1DM區間時也多呈下降趨勢；羧基肽酶和酸性蛋白酶活力在發酵前期(發酵的第7、14、35天)隨EFE添加量的提高多呈明顯的下降趨勢，發酵第35天后呈先下降后上升趨勢，且均以對照組的酶活力最大。

3 討論

3.1 EFE對FTMR概略養分和WSC含量的動態影響

通常，自然條件下青貯飼料中常見的微生物種類包括乳酸菌、酵母菌、好氧細菌、大腸桿菌及其他腐敗菌，其中乳酸菌具有嗜酸、糖和鹽的特性，其余微生物則主要以糖類和蛋白質為發酵底物，他們是青貯飼料干物質中碳水化合物和蛋白質降解的主要因素，而乳酸菌發酵程度和數量是青貯飼料品質的關鍵[26]。本試驗結果表明，同一處理條件下，隨著發酵時間的推移，FTMR的DM、CP含量在發酵的第0～35天的區間呈下降趨勢，35 d后DM的損失減少，含量趨于穩定，而全期看CP和WSC含量均呈現發酵時間延長的顯著遞減效應，這種趨勢與張放等[27]和賈婷婷等[28]報道的青貯發酵的養分變化規律一致，表明本試驗條件下FTMR在發酵的第35天后微生物菌群活躍度達到高峰期，達到了良好貯存的目的。對于纖維類物質，ADF和NDF含量均隨發酵時間的延長呈下降趨勢，且以NDF下降幅度較大，主要原因可能是乳酸菌的快速生長導致物料有機酸的迅速積累軟化了部分易解離的細胞壁成分，在實際測定時容易被洗滌劑洗脫，但這種解離效應是有限的，NDF組分較多可能是下降幅度較大的主要原因。

研究表明，添加促進發酵型青貯添加劑可通過促進青貯飼料乳酸菌迅速成為優勢菌群，減少蛋白質的分解和營養物質的消耗[29-31]，外源纖維素酶是其中之一。Nadeau等[32]報道，在苜蓿和鴨茅(Dactylisglomerata)青貯中添加EFE后，其NDF、纖維素和半纖維素降解率分別比對照組提高了33%、37%和27%；此外，牧草品種差異，EFE對NDF的降解程度有所差異，報道指出，黑麥草(Loliumperenne)比對照組提高13%、雀稗草(Paspalumnotatum)提高了21%～33%、小麥(Triticumssp.)秸稈提高了40%～49%、甘蔗(Saccharumofficinarum)渣提高了77%[33-35]。本試驗結果顯示，EFE添加到FTMR后，同一發酵期內試驗組的干物質損失高于對照組，而對照組的氮和WSC含量的損失總體上高于試驗組，大部分試驗組ADF和NDF降解率高于對照組，且以0.08 g·kg-1DM添加量表現較為好，這與馬清河等[36]報道的EFE在青貯飼料中的應用效果基本一致。表明EFE用于高粗料型FTMR中，可降低纖維類物質含量，進而提高能量價值，是配制“節糧型日糧”的可選添加劑之一。

3.2 EFE對FTMR發酵參數的動態影響

pH值是評價青貯飼料發酵品質的最重要的基礎指標，底物pH值越低，對有害菌的生長和繁殖的抑制效應越有利，當pH值下降到4.2以下時，能抑制絕大部分有害菌的生長，進而使得青貯飼料很好地保存[37]。氨態氮和有機酸(乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等)是微生物為了生長和繁殖的需要，利用底物養分(氮源和碳源)而產生的代謝產物，其中氨態氮和丁酸含量越高表明有害菌發酵程度越深，飼料營養價值降低，乙酸和乳酸含量的迅速提高表征良性發酵，減少營養成分的不良損失，而丙酸與乙酸的相對含量則表示菌群結構的差異導致發酵類型的變化[38]。對于FTMR來說，其發酵原理與青貯飼料基本相同，因此上述評價指標同樣適用于FTMR。本試驗結果表明，隨著發酵時間的推移，各處理組pH值均呈現下降的整體趨勢，相反，氨態氮、乙酸、丙酸和乳酸含量呈整體上升的趨勢，而丁酸含量呈現先下降后上升的趨勢，即發酵品質具有時間效應，這種變化趨勢與前人研究結果一致[27,39]，數值上看，試驗組在發酵第49天的pH值均低于4.20，達到合格青貯飼料的標準，但普遍高于單一原料青貯飼料的pH值[40-41]，這可能是由于FTMR本身營養水平較高，特別是含氮量和緩沖能較高，對有機酸有一定的緩沖作用，導致絕對數值高于單一青貯飼料，因此FTMR中的可溶性碳水化合物含量與含氮量或緩沖能之間的互作效應可能是未來需要研究和回答的問題，這為兼顧FTMR配方營養水平合理性和發酵品質的優良性提供理論依據。

本試驗中，氨態氮與總氮的比值隨EFE添加量的提高有先上升后下降的趨勢，且數值均小于10%，達到MacDonald[42]報道的保存良好的青貯飼料的標準，發酵正常。同時，表明EFE在抑制FTMR蛋白質的降解具有劑量效應，這種效應在乙酸和乳酸含量的變化規律中得到對應體現，這結果與pH值結果相互印證，且以0.8和1.6 g·kg-1DM的添加效應較好。劑量效應的原因可能是由于過高劑量的EFE吸附和占據了有限的植物細胞壁中纖維素晶體的大部分結合域，競爭性地抑制了FTMR發酵過程中微生物自身產生的纖維類物質降解酶的作用效應[19]。這種效應與Nsereko等[43]報道的關于纖維素酶與反芻動物瘤胃纖維降解類微生物的關系的研究結果類似[44]。

從作用途徑和機理上看，任海偉等[45]利用高通量測序技術研究了EFE對青貯飼料細菌多樣性的影響，結果表明，EFE通過對底物發酵前期部分結構性碳水化合物的降解，補充了乳酸菌可利用的可溶性糖類，一方面讓乳酸菌迅速成為優勢菌群，另一方面乳酸的迅速積累又加速抑制了芽孢桿菌、耶爾森氏菌、沙門氏菌、彎曲桿菌和腸桿菌等致病腐敗菌，本試驗中各處理的乳酸含量變化趨勢也印證了這個結果，同時也解釋了EFE減少了底物氮的損失規律。

3.3 EFE對FTMR酶活力的動態影響

纖維素酶是由內切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase)、外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase)組成的酶類總稱，其作用與由木聚糖組成的半纖維素酶具有協同效應，它們是自然界水解纖維類物質的主要形式[46]。關于青貯飼料中應用纖維素酶復合物的研究，前人已有報道[47-48]，均表現出對青貯飼料發酵品質和營養價值方面的正效應，但還未見從發酵后酶活力的變化規律探究其作用機理的報道。本研究結果表明，各處理組纖維素酶和木聚糖酶活力隨發酵時間的延長呈下降趨勢，表明隨著發酵環境有機酸的積累，pH下降對酶活力產生了抑制作用，這與酶促反應條件的規律和本試驗中NDF和ADF的降解率結果相吻合。研究表明，纖維素酶的來源決定了其酶促反應的作用條件，其中霉菌產生酸性和中性纖維素酶，細菌則產生堿性或酸性纖維素酶；酸性纖維素酶在酸性條件下較穩定，其反應最佳的pH值范圍為 3～6；中性纖維素酶在中性條件下較穩定，其反應最佳期的pH值為6～7；堿性纖維素酶的最佳反應pH值為9～10[49]。本試驗結果顯示，同一發酵時間點隨EFE添加量提高纖維素酶活力呈明顯的上升趨勢，并未隨pH值降低而顯著下降，這可能與本試驗所用的EFE屬酸性纖維素酶類型有關，但具體原因還需要試驗研究進一步證明。

研究證實，羧基肽酶和酸性蛋白酶是牧草中存在的兩種主要的植物蛋白水解酶，植物脫離土壤或其他生存條件后，自身代謝加快后會激活更多的蛋白酶將植物蛋白質水解為小肽、氨基酸和氨態氮[50]，因此這兩種酶的活力可以代表青貯飼料中蛋白降解的能力，以及潛在的有氧穩定性。本試驗結果表明，羧基肽酶和酸性蛋白酶活力隨發酵時間延長而逐漸降低，且以羧基肽酶降幅較大，與楊智明等[24]報道的苜蓿青貯中酶活力變化規律一致，且pH值的變化規律基本吻合。此外，本試驗結果還可看出，EFE有加速兩種蛋白酶活力降低的作用，但其機理是通過降低有機酸積累，間接抑制其酶活力還是通過直接的途徑需要進一步研究證實。

4 結論

本試驗條件下，FTMR的營養價值和發酵品質隨發酵時間呈動態變化；添加EFE可促進FTMR中纖維類物質的降解、有機酸的積累和自身纖維類物質的酶活力，抑制羧基肽酶活力和酸性蛋白酶活力，減少蛋白質的損失，且存在添加劑量效應，適宜添加量為0.8～1.6 g·kg-1DM。