小鼠白假絲酵母菌陰道炎模型中微環境的變化研究

拜紅霞 陸顯義 施啟豐 房靈 顧敏紅 陸勝 王昊玨△

(無錫市錫山人民醫院/東南大學附屬中大醫院無錫分院，(1.檢驗科；(2.婦產科；(3.病理科；(4.皮膚科，江蘇 無錫 214015)

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是育齡婦女常見的條件真菌感染，絕大部分感染由白假絲酵母菌引起，約占85%～90%[1-2]。相關研究常用小鼠陰道炎模型進行，在構建白假絲酵母菌陰道炎模型中雌激素化發揮著重要作用[3-4]。以往雌激素化的方法為肌注苯甲酸雌二醇，但隨著藥品市場的更新換代，苯甲酸雌二醇難尋蹤影。本研究擬通過喂食戊酸雌二醇(補佳樂)片劑達到雌激素化的目的來建立陰道炎小鼠模型，并了解其微環境變化情況，以期為白假絲酵母菌陰道炎相關研究提供合適替代的動物模型。

1 材料與方法

1.1儀器 型號BSC-1004IIA生物安全柜(蘇凈安泰AIRTECH公司)；MCO-18AC二氧化碳培養箱(日本松下)；MODELCX23LEDRFS1C型生物顯微鏡(日本奧林巴斯)；型號YXQ-LS-50壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司)； Multiskam Ascent型全自動酶標儀(芬蘭雷勒公司)。

1.2試藥 戊酸雌二醇片(補佳樂，DELPHARM Lille S.A.S.公司，批號：198A3);瓊脂粉(批號：20170406)、蛋白胨(批號：20170518)、葡萄糖(批號：20170214)均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3動物 SPF級雌性ICR小鼠，體質量20～25 g，購自揚州大學比較醫學中心，動物質量合格證號：SCXK(蘇)2017-0007。 在江蘇省血吸蟲病防治研究所動物房[許可證號：SYXK(蘇)2017-0050]分籠飼養，控制環境溫度(20±2) ℃，濕度55%～65%，光照12 h，嚙齒類動物飼料喂養，自由飲水。

1.4菌株 白假絲酵母菌標準株購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(編號：AF206001，批號：20170721)。

1.5菌懸液的制備 將菌株接種在含1%蛋白胨和4%葡萄糖液培養基中，25 ℃恒溫振蕩培養，16～18 h后取出，于無菌操作臺中混勻后，取1 mL菌液測其在560 nm處的吸光度(A)值，根據測得的菌液A值與標準曲線上相比較得到菌液濃度。用生理鹽水將菌液稀釋為5×108cfu·mL-1，取1 只小鼠腹腔注射1 mL菌液，待小鼠死亡后，對其腹部進行酒精消毒后剖開腹腔，用無菌棉簽取樣，接種于培養基中，25 ℃恒溫振蕩培養16～18h。用生理鹽水再將菌液稀釋為5×108cfu·mL-1，另取1只小鼠重復接種、取樣，菌液經過打入小鼠腹腔轉種2次增強毒力后再在1%蛋白胨和4%葡萄糖液培養基中，25 ℃恒溫振蕩培養16～18 h，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)調整菌懸液濃度[5]，使菌懸液濃度為5×108cfu·mL-1。

1.6動物分組及模型建立 將160只小鼠隨機分成四組：戊酸雌二醇低劑量組(A，0.005 mg/10 g)、戊酸雌二醇中劑量組(B，0.05 mg/10 g)，戊酸雌二醇高劑量組(C，0.5 mg/10 g)，正常對照組(D)，每組40只。A、B、C組小鼠在接種白假絲酵母菌前給予戊酸雌二醇混懸液灌胃，D組小鼠給予同體積(0.10 mL/10 g)生理鹽水，連續灌胃21 d。灌胃第8天為造模日，于小鼠陰道內灌入20 μL菌懸液(含菌量1×107cfu)。每天觀察小鼠精神狀態、外陰及分泌物情況。

1.7指標檢測

1.7.1pH 值檢測 分別于造模后第2 、4、7、14天隨機取小鼠5只，用自制小棉簽無菌生理鹽水濕潤后，用無菌脫脂棉吸除多余水分，插入小鼠陰道，旋轉2周沾取分泌物，滴在精密pH 試紙上，迅速與比色卡比色，并記錄結果[6]。

1.7.2血清雌激素水平測定 灌洗日小鼠取尾血后處死。血液置于無菌離心管中，放于低溫高速離心機中15 000 rpm，離心15 min[7]，用微量加樣器取血清液，置于無菌離心管中，存放于-80 ℃冰箱中保存。標本收集完整后，按試劑盒的說明書檢測小鼠血中雌激素濃度。

1.7.3陰道灌洗液菌落計數 確定接種后的第2、4、7、14天為灌洗日，每個灌洗日各組隨機另選取5只小鼠，先用微量加樣器取100 μL 無菌 PBS 反復沖洗陰道 8～10 次，灌洗液置于潔凈無菌管中，取 10 μL 涂片鏡下觀察芽生孢子及菌絲生成情況，取10 μL接種于保羅瓊脂培養基上 35 ℃培養48 h后，計數菌落形成單位(CFU計數即菌落形成單位，以個菌落/mL為單位計數)[8]。另取 50 μL 灌洗液用 PBS 10 倍比稀釋到 10-6，每個稀釋度分別取 50 μL 涂于 Rogasa 培養基上，每個稀釋度設兩個平行板，涂布棒涂布均勻。置燭缸中，37 ℃，48 h 培養后，選取 30 300 個菌落的平板乳桿菌鑒定及活菌計數(CFU/mL)[9]鑒定乳桿菌，凡符合下列條件者均可認為是乳桿菌[10]： (1)革蘭氏染色陽性，無芽孢，細長有彎曲或呈球桿狀、桿狀，單個、成雙或鏈狀，無動力; (2)微需氧或兼性厭氧，但在厭氧環境中生長更好; (3)生長最適溫度為 37 ℃，最適pH值5.6～6.2; (4)觸酶陰性，不產色素; (5)分解葡萄糖。

1.8陰道組織病理學檢查 灌洗日小鼠取尾血后處死。取陰道組織(1.5 cm×2.0 cm)立即置于4%多聚甲醛溶液中。將4%多聚甲醛溶液浸泡24 h后的小鼠陰道組織作石蠟包埋、切片，進行HE染色[11]。

2 結 果

2.1一般情況觀察結果 正常對照組在整個實驗中飲食正常，未見煩躁、 外陰紅腫、分泌物增加等現象出現;其余各組在接種白假絲酵母菌后相繼出現煩躁、外陰紅腫、分泌物增加等現象。

2.2陰道灌洗液涂片鏡檢 A、B、C組小鼠自第2 天起灌洗液涂片可見芽生孢子和假菌絲，第4 、7 天的涂片中尤為密集，D組僅第2 天有少量芽生孢子及假菌絲，第4天未見真菌生長。

2.3陰道 pH情況 接種后，各組小鼠陰道 pH 值均升高，與正常對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05) 。見表1。

表1 小鼠陰道 pH 值

注：與正常對照組相比，☆P<0.05。

2.4血中雌激素濃度 喂食不同劑量的戊酸雌二醇后，小鼠血中雌激素濃度差異有統計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 小鼠血中雌激素濃度

2.5陰道乳桿菌計數 A、B、C組小鼠陰道乳桿菌菌落數都明顯降低，與正常對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。模型組小鼠陰道乳桿菌菌落數持續降低，在接種的第7天逐漸開始升高。見表3。

表3 小鼠陰道乳桿菌菌落數[活菌數

注：與正常對照組相比，☆P<0.05。

2.6小鼠陰道灌洗液白假絲酵母菌菌落計數結果 各組小鼠在接種后各灌洗日取其陰道灌洗液進行白假絲酵母菌菌落計數結果見表4。自第2天起，A、B、C三組小鼠陰道內即有較高水平的cfu并持續至觀察期末，于第4天達峰值，后逐漸下降；第4、7天A、B、C組兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。至第14天，A、B、C組兩兩相比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

表4 接種后不同時點三組小鼠陰道灌洗液真菌載量比較

注：A、B、C組兩兩比較，△P>0.05；☆P<0.01。

2.7HE染色結果 正常對照組小鼠陰道組織未見明顯炎性細胞浸潤，戊酸雌二醇低、高劑量組小鼠陰道組織黏膜內、黏膜下可見以多形核粒細胞為主的炎性細胞浸潤，戊酸雌二醇高劑量組最為明顯。 見圖1。

圖1 HE染色結果

3 討 論

白假絲酵母菌是女性生殖道最常見的條件致病菌，75%的女性一生中至少患過一次白假絲酵母菌性陰道炎。白假絲酵母菌屬條件致病菌，其致病性主要取決于病原體的數量、毒力、入侵途徑以及機體的抵抗力、適應性等[12]，機體內的這種平衡狀態一旦被某些因素破壞，白假絲酵母菌便出芽生成假菌絲，酵母相轉變成菌絲相，大量繁殖，導致皮膚、黏膜及全身性的真菌病[13]。

乳桿菌是陰道里的正常菌群，乳桿菌可以通過產生乳酸、過氧化氫、細菌素而對假絲酵母菌有拮抗作用。大量乳酸的產生可以降低陰道pH值，低pH值可以抑制假絲酵母菌的生長，乳桿菌在體外可以干擾白假絲酵母菌對陰道上皮的粘附。正常情況下，雌激素可以影響乳桿菌的數量，當雌激素水平升高時乳桿菌數亦升高。而假絲酵母菌是陰道中的條件致病菌，雌激素水平的升高可以使陰道上皮COX-2表達上調[14]，從而降低陰道局部免疫力，有利于假絲酵母菌的繁殖；且雌激素水平的升高也可以使糖原表達上調，糖原為假絲酵母菌生長提供營養，也利于假絲酵母菌的生長和繁殖。在假絲酵母菌性陰道炎中，白假絲酵母菌的大量繁殖可以升高陰道pH值，從而抑制乳桿菌的生長，乳桿菌的減少導致陰道局部的抵抗力下降，從而加重了假絲酵母菌的感染。

高雌激素水平可增強白假絲酵母菌的毒力，使個體對白假絲酵母菌的易感性增加。以往研究多以尾靜脈注射苯甲酸雌二醇達到雌激素化后接種白假絲酵母菌建立白假絲酵母菌性陰道炎模型[15]。但苯甲酸雌二醇為油劑，且需尾靜脈注射，存在藥物難購買、操作難度高等缺陷。故本實驗采用戊酸雌二醇灌胃達到雌激素化。

本研究結果表明，小鼠陰道感染白假絲酵母菌后，高雌激素狀態更利于白假絲酵母菌的繁殖，乳桿菌的生長受到抑制，小鼠陰道pH值升高，更不利于乳桿菌的生長，乳桿菌的絕對數量也是降低的。

本研究發現，戊酸雌二醇高劑量組菌落計數在各時間點均高于其它組，并于第4天達到高峰(6.825±1.247)，與其他兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。組織病理學結果顯示，該組在HE染色下可見有PMNs浸潤。此外，A、B、C各組菌落計數均呈現出先升高后下降的態勢，這可能與白假絲酵母菌毒力減弱、小鼠陰道的自凈作用有關。從本實驗結果可以看出，戊酸雌二醇灌胃可達到雌激素化的目的，雌激素濃度高低對小鼠陰道菌落形成有顯著影響，并能改變小鼠的陰道微環境。高濃度雌激素更易獲得小鼠陰道炎模型。