氮素形態對喜樹葉片生長、葉綠素熒光參數及葉綠體相關基因表達的影響

卞賽男，常鵬杰，王寧杭，劉志高，張明如，吳家勝，申亞梅，王小德

（1.浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300； 2.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300）

喜樹Camptotheca acuminata是中國特有樹種，屬于藍果樹科Nyssaceae喜樹屬Camptotheca植物，因葉片含有抗癌物質喜樹堿（camptothecin），被認為是重要藥用植物。施肥是高效培育喜樹、增加葉片產量的重要措施之一［1］。氮素是植物生長和產量形成的首要因素，植物吸收氮素的形式主要有銨態氮（NH4＋-N）和硝態氮（NO3--N）。研究表明：合理增施氮肥可以促進植物生長，提升植物品質［2］；除了影響光合作用，氮素還影響植物中抗氧化酶和膜脂過氧化物的生理代謝。過量氮肥會打破植物內活性氧代謝的平衡，破壞膜系統結構［3］，導致植物生理系統的紊亂，影響植物類囊體數量和類囊體蛋白形成。psbA，psbB和psbC是光系統Ⅱ核心復合體（PSⅡ）中重要的蛋白編碼基因。卡爾文循環中，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（rubisco）是光合特性中碳同化的關鍵酶，主要由大、小2個亞基組成，在植物碳同化過程中具有重要作用，影響植物的光合特性［4］。不同植物在不同環境和生育期表現出對不同氮素形態吸收的顯著性差異［5-6］。 三葉青Tetrastigma hemsleyanum［7］和鐵核桃Juglans sigillata［8］都表現出對 NO3--N 吸收的偏向性，而水稻Oryza sativa的葉綠素熒光動力學參數在2種氮素營養下沒有差異［9］；出現差異的原因可能與研究對象和條件都存在一定的相關性［10］，但氮素形態對植物葉綠素熒光動力學過程及其參數的影響機制，目前尚無明確定論。總的來說，不同植物對氮素形態吸收具有偏向性，而后者直接影響了植物生長和葉綠素熒光特性，從而影響植物生長的產量和品質，因此合適的氮肥水平及形態對植物生長具有重要意義。近年來，關于氮肥對喜樹生長的研究，主要集中在氮肥處理的不同水平［11］，而尚未采用不同氮素形態的不同水平對喜樹進行處理研究。因此，本研究以2年生喜樹實生苗為實驗材料，采用不同水平的銨態氮和硝態氮施肥處理，通過研究葉片生長、葉綠素熒光特性和葉綠體相關基因的表達，來探究適于喜樹生長的最佳氮素水平和氮素形態，為喜樹施肥栽培提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗方法

于2017年4月5日選取無病蟲害、生長健壯、規格基本一致的優質2年生喜樹實生苗270株（江西九江森淼綠化苗木公司），栽植在直徑30.0 cm，高40.0 cm的花盆中。栽植基質為V（泥炭）∶V（珍珠巖）∶V（園土）=1∶1∶3， 填土（10.0±0.2）kg·盆-1， 土壤 pH 值為 6.8， 土壤電導率（EC）為 0.305 mS·cm-1，水解氮為86.6 mg·kg-1，速效磷為3.2 mg·kg-1，速效鉀為94.6 mg·kg-1。苗木于浙江農林大學平山試驗基地（30°15′50.09″N，119°42′54.67″E）緩苗 2 月，緩苗期間正常澆水， 待全部成活后， 于 6 月 18 日搬于浙江農林大學溫室內（30°15′30.39″N， 119°43′26.92″E）進行施肥處理。

試驗以清水組為對照（ck），銨態氮處理組使用硫酸銨［（NH4）2SO4］施肥，施氮量分別為2.5（T1），5.0（T2），7.5（T3）和 10.0（T4） g·株-1，硝態氮處理組使用硝酸鉀（KNO3）施肥，施氮量分別為 2.5（W1）， 5.0（W2），7.5（W3）和 10.0（W4）g·株-1。 所有盆栽苗均隨機擺放， 葉片之間無重疊， 各盆配有直徑40.0 cm的托盤，防止養分流失，每處理設置10株，重復3次。試驗從6月18日至10月4日，隔15 d施肥1次。供試氮肥均為分析純（AR99%），購自國藥（硫酸銨CAS#:7783-20-2，硝酸鉀CAS:7757-7）。施銨態肥時，肥料中加入7.0 μmol·L-1二氰二氨（C2H4N4,DCD）以抑制硝化反應，于0，30，60，90，105 d測定相關數據。試驗期間進行正常的管理。

1.2 測定項目和方法

葉長：分別于處理前后（0，105 d）選第2輪葉的倒數第3，4，5片葉子，用直尺測量苗木的葉長（測量3株，取平均值），從葉片與葉柄連接基部到葉片尖端，精確到0.1 cm。葉面積：于處理前后（0，105 d）選第2輪葉的倒數第3，4，5片葉子，用方格紙測定苗木的葉面積 （測量3株，取平均值），從葉片與葉柄連接基部到葉片尖端的整個范圍，精確到0.01 cm2。葉綠素a和葉綠素b：采集喜樹頂端第5，6片葉，參照李合生［12］乙醇浸提法測定葉綠素質量分數。葉綠素熒光參數：采用Li-6400便攜式光合儀（LI-COR，Lincoln，美國），于晴天上午9：00-11：00測定植株上位葉（第2輪葉倒數3，4片）葉綠素熒光參數。葉片暗適應30 min后測定初始熒光產量（Fo），隨后施加1次強閃光（6000 μmol·m-2·s-1，脈沖時間0.7 s）測最大熒光產量（Fm），然后在自然光下適應20 min，待熒光基本穩定再測得穩態熒光產量（Fs），最后給予1次強閃光，獲得光適應下的最大熒光產量（Fm′）和最小熒光（Fo′）。各處理均3次重復。 暗反應下 PSⅡ最大光化學效率 Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm，光系統下 PSⅡ最大捕獲效率 Fv′/Fm′=（Fm′-Fo′）/Fm′，光化學猝滅系數 qP=（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′）， 非光化學猝滅系數 qNP=1-Fv′/Fm′［13］。 測定葉綠素熒光參數時， 同時任選3株，從各株頂端6～9片葉中任意采集3片，放入液氮罐中帶回實驗室置于-80℃冰箱中保存，用于測定光合酶基因的表達。葉綠體基因的表達：采用RNAperp Pure Plant Kit（TIANGEN，北京）試劑提取喜樹 RNA；參照 Reverse Transcriptase M-ML V（Takara，大連）試劑說明書合成 cDNA，于-20℃儲存備用。從美國國立生物技術信息中心（NCBI）上獲得喜樹葉綠體基因序列，以Actin為內參基因，用 Primer Express software（Applied Bio systems）設計引物（表1）。反轉錄產物cDNA稀釋10倍后，用SYBRPrimix Ex TaqTM試劑盒（Takara，大連）進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR），利用Light Cycler 480Ⅱ（Roche）熒光定量儀器進行目的基因qRT-PCR表達分析，反應體系為20.0 μL，其中SYBRPrimix Ex TaqTM熒光染料10.0 μL， cDNA 模板 2.0 μL， 上下游引物（10 μmol·L-1）各 0.8 μL， 雙蒸水6.4 μL。兩步法PCR擴增標準程序：預變性95℃30 s；聚合酶鏈式反應95℃5 s，61℃ 30 s，40個循環，每個樣品重復3次，采用2-ΔΔCt算法分析結果。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers sequence of target genes

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（α=0.05）。利用Origin 9.0軟件作圖。圖表中數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 氮素處理水平對喜樹葉片生長的影響

表2顯示：喜樹生長至105 d，葉長和葉面積均增加，處理組葉長和葉面積均顯著高于ck（P＜0.05）。隨著氮素處理水平的提高，葉長和葉面積均呈先上升后下降趨勢。與其他處理相比，T3和W3葉長和葉面積最大，葉長較ck（8.10±0.02）cm分別增加了32.3%和78.5%，葉面積較ck（25.43±0.15）cm2依次增加了130.0%和242.0%；且硝態氮處理水平下的葉長和葉面積均高于銨態氮，說明硝態氮更有利于植物生長。

2.2 氮素處理水平對喜樹葉片葉綠素質量分數的影響

2.2.1 銨態氮不同處理水平對喜樹葉片葉綠素質量分數的影響 由表3可知：隨生長時長，植株葉片葉綠素質量分數總體升高，除T4外，其他處理葉綠素質量分數60 d較30 d時有所下降，90 d時又有所上升，至105 d時達到最大值。相同生長時長下，不同處理水平間差異較小。生長至105 d時，T3葉綠素質量分數顯著高于其余處理（P＜0.05），較ck，T1，T2和T4依次上升了35.2%，17.2%，23.8%和15.2%。2.2.2 硝態氮不同處理水平對喜樹葉片葉綠素質量分數的影響 表4表明：隨處理時間的延長，硝態氮處理下喜樹葉片葉綠素質量分數變化顯著；但不同處理水平相比，質量分數差異較小。處理30～60 d，所有銨態氮處理下葉綠素質量分數均顯著高于ck，各處理水平相比，W3處理下葉綠素質量分數最高，較ck和其他處理依次高出73.9%，44.5%，10.2%和31.3%。處理90～105 d，ck和W1的葉綠素質量分數繼續上升，W2，W3和W4先上升后下降，105 d時，W1葉綠素質量分數高于其他處理，W4最低。

表2 氮素處理水平對喜樹葉長和葉面積的影響Figure 2 Effects of different concentrations of ammonium nitrogen and nitrate on leaf lengh of Camptotheca acuminata

表3 不同銨態氮處理水平對喜樹葉片葉綠素質量分數的影響Table 3 Effects of different concentrations of ammonium nitrogen and nitrate on chlorophyll content in C.acuminata

表4 不同硝態氮處理水平對喜樹葉片葉綠素質量分數的影響Table 4 Effects of different concentrations of ammonium nitrogen and nitrate on the chlorophyll content in C.acuminata

2.3 氮素處理水平對喜樹葉片葉綠素熒光參數的影響

2.3.1 銨態氮不同處理水平對喜樹葉片葉綠素熒光參數的影響 由圖1可知：至30 d，Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP呈顯著上升趨勢 （P＜0.05），qNP呈下降趨勢，T4處理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP達到最大。 到60 d時，T2和T3處理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP達到最大值，與ck相比，依次提高了1.4%，9.2%和84.8%。60 d時T3處理組各測試參數顯著高于其他處理（P＜0.05），T4顯著低于其他處理。處理90～105 d，T2，T3和T4處理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和 qP值呈下降趨勢，T1處理下 Fv/Fm下降，Fv′/Fm′和 qP值呈上升趨勢，T3依然高于其余處理。90 d時，T3處理下qNP顯著低于其他同類處理，與ck相比下降了12.9%；105 d時，T4處理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP降到最小，顯著低于其他處理；與ck相比，依次下降了11.1%，3.3%和5.6%。

2.3.2 硝態氮不同處理水平對喜樹葉片葉綠素熒光參數的影響 圖2顯示：30 d時，不同硝態氮處理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和 qP顯著上升，qNP顯著下降， 其中 W4處理 Fv/Fm和 Fv′/Fm′達到最大值， 此后顯著下降（P＜0.05）。60 d時，W2和W3處理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP達到最大值，與ck相比，依次上升了2.6%，12.3%和115.8%；此時W3處理下這3個參數值顯著高于其他處理。處理90～105 d，W2，W3和W4處理Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP值呈下降趨勢； W1處理Fv/Fm下降，Fv′/Fm′和qP值上升； W3處理Fv′/Fm′和qP值依然高于其他處理，qNP顯著低于其他處理，與ck相比下降了29.9%。至105 d時，W4處理Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP顯著低于其他處理，與ck相比，依次下降了11.1%，3.3%和5.6%。

圖1 銨態氮不同處理水平對喜樹葉片葉綠素熒光參數的影響Figure 1 Effects of different concentrations of ammonium nitrogen on chlorophyll fluorescence characteristics of Camptotheca acuminata

2.4 氮素形態和處理水平對喜樹葉片核心復合體葉綠體基因和光合酶基因表達的影響

以不同處理在0 d時的表達量為ck，增施氮肥對PSⅡ蛋白編碼基因psbA（圖3A和圖3B），psbB（圖3C和圖3D），psbC（圖3E和圖3F）和光合酶基因RbcL（圖3G和圖3H）表達的影響顯著（P＜0.05）。由圖3可知：生長30 d，所有基因表達量顯著提高。處理60 d時，T3處理下psbA表達上調，其余處理下所有基因表達顯著下調（P＜0.05），T3和W3處理下psbA，psbC和RbcL表達量顯著高于其他同類處理（P＜0.05），所有銨態氮處理psbB隨處理水平的升高而升高，T2處理psbB表達量顯著低于其他同類處理（P＜0.05）；與T1，T2和T4相比，T3處理psbA表達量上升了76.3%，50.8%和55.6%，psbC表達量上升了15.8%，16.5%和52.5%，RbcL表達量上升了66.8%，34.4%和39.9%。與W1，W2和W4相比，W3處理psbA表達量上升了71.9%，57.9%和75.6%；psbC表達量上升了8.7%，61.7%和15.4%；RbcL表達量上升了47.1%，22.3%和79.1%，處理90～105 d，T3和W3也保持顯著優勢，90 d時，T3較T1，T2和T4依次增加了88.9%，28.7%，379.1%，W3較W1，W2，W4依次增加了201.8%，52.3%和 45.5%。105 d時，T4處理psbA和RbcL表達量顯著低于其他同類水平處理，達到最小值。

圖2 銨態氮不同處理水平對喜樹葉片葉綠素熒光參數的影響Figure 2 Effects of different concentrations of nitrate nitrogen on chlorophyll fluorescence characteristics of C.acuminata

3 討論

植物不同生長過程對氮肥需求不同，在合理范圍內增施氮肥，可以顯著促進植物生長，提高植物的產量和品質［14］。研究認為：與銨態氮相比，硝態氮具有更好的親和力、氮轉運和吸收效果［15］。本研究發現：銨態氮和硝態氮均提高了喜樹的葉面積和葉長生長量，以T3和W3優勢最為明顯；相比而言， 硝態氮處理下喜樹生長更優；隨著氮素水平的繼續提高，喜樹葉長和葉面積顯著下降，說明植物吸收利用氮素存在一定限度，過量添加不利于生物量的積累［16］。

圖3 氮素形態和氮素水平對喜樹葉綠體基因和光合酶基因表達的影響Figure 3 Effects of different ammonium nitrogen and nitrate on the expression of chloroplast genes and photosynthetic enzyme genes in C.acuminata

葉綠素參與光能的吸收傳遞及分配，是重要的光合色素；不同氮素形態對植物葉綠素合成及對光能吸收、傳遞、捕獲和轉換具有重要影響［17］。研究表明：適量增加氮素可促進米老排Mytilaria laosensis［18］和菘藍Isatis indigotica［19］葉綠素合成， 提高光合效率。 本研究發現： 合理范圍內（T1～T3， W1～W3）增施氮肥，喜樹葉片葉綠素合成和光合效率顯著提高，以T3和W3效果最佳。對油麥菜Lactuca sativavar.longifoliaf［20］和黃瓜Cucumis sativus［21］而言，硝態氮處理下葉綠素相對含量和葉綠素熒光參數高于銨態氮處理；本研究同樣發現，處理初期，相同氮素水平下，硝態氮處理組葉綠素質量分數和葉綠素熒光參數顯著高于銨態氮，這可能與植物對氮素形態的吸收代謝有關。李曉靜等［22］發現銨態氮以被動吸收為主，擴散進入生物膜并破壞生物膜結構，阻礙質子動力勢的建立和碳同化物的形成；而硝態氮以主動吸收為主，進入生物膜并儲存于液泡中，對植物體內離子平衡、碳同化物的形成有利。RAAB等［23］研究發現：高氮會造成葉綠素酶失活，葉綠素分解，光系統Ⅱ遭到破環，光子傳遞受阻，使植物發生光抑制現象；如小麥Triticum aestivum在高氮處理下，植物光合結構和功能受到傷害，光合特性降低［24］。本研究發現，處理中后期（60～105 d）高氮水平下（T4和W4），喜樹的葉綠素質量分數、葉綠素熒光特性顯著下降。原因可能是高銨態氮造成銨離子在體內積累，類囊體結構被破壞，質子形成受阻，形成氧化磷酸化，破壞碳水化合物的形成，導致葉綠素合成受阻和植物光合特性降低［25］；高硝態氮處理破壞土壤理化性質，造成喜樹缺素癥，表現出對鐵、鎂等元素吸收的拮抗作用，從而影響植物光合特性［26］。不同氮素形態或水平對qNP影響無顯著規律，其原因還需要進一步研究。

光系統Ⅱ（PSⅡ）由多亞基復合組成，吸收外界光能并將激發能轉移到反應中心；psbA，psbB和psbC是編碼PSⅡ反應中心蛋白質基因，RbcL基因編碼核酮糖二磷酸羧化酶的大亞基。研究發現：增施氮肥可以提高植物碳同化能力，促進RbcL表達［27］。以甜菜Beta vulgaris［28］為例，銨態氮處理，其葉片中Rubisco酶基因表達高于硝態氮處理。本研究中，處理初期（30 d）不同氮素形態處理均促進了葉綠體基因的表達，相同水平下硝態氮處理RbcL的表達高于銨態氮；至中后期，T1和W1處理下RbcL的表達顯著高于其他同類處理，說明適宜的銨態氮和硝態氮處理提高了植物的碳同化能力；相比之下，硝態氮較銨態氮更有利于提高喜樹的碳同化能力，進一步說明了喜樹是喜硝植物［29］。葉綠素熒光過程極其復雜，受各種刺激調控，植物碳同化和氮同化可能存在相應的競爭關系。本試驗60 d時，葉綠體基因表達下調，可能原因是隨著植物對長期環境變化的響應和適應，相關葉綠體基因表達受到影響［30-31］。環境脅迫造成PSⅡ中的蛋白質破壞，受蛋白編碼基因刺激表達的影響，受損的蛋白質不斷被新合成的蛋白質替代。SHAO等［32］發現：2.0 mg·L-1氮處理下，連苯三酚引起的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa損害可通過psbA的刺激表達彌補。本實驗中psbA，psbB和psbC在不同氮素水平處理下表達差異不顯著，可能是氮素刺激了PSⅡ的蛋白質合成，形成自我保護機制［33］。高氮處理下，植物光電子傳遞受阻、熱耗散能力顯著下降、碳同化能力下降，發生了明顯的光抑制現象［34］，也會造成葉綠體基因的表達顯著下調。高銨態氮下銨離子的積累破壞了類囊體蛋白，降低了Rubisco酶活力，而高硝態氮下，植物對三價鐵離子、二價鎂離子的吸收下降，Rubisco酶活力受損，導致葉綠體基質中類囊體光驅電子的轉移受阻礙，從而影響質子中鐵硫-氧化蛋白的還原［35］。