噬菌弧菌N1對淡水和海水養殖水體細菌群落影響PCR-DGGE分析

陳慧黠，韓民泳，于佳豪，劉 琳

噬菌弧菌N1對淡水和海水養殖水體細菌群落影響PCR-DGGE分析

陳慧黠1，韓民泳1，于佳豪1，劉 琳2

（1. 大連海洋大學水產與生命學院，海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧 大連 116023；2 青島農業大學生命科學學院， 山東省應用真菌重點實驗室，山東 青島 266109）

【】研究噬菌弧菌sp. N1在一個投放周期內對淡水和海水養殖環境中細菌、弧菌總數及細菌群落結構的影響。自市售微生態制劑分離蛭弧菌N1并進行分子鑒定，測定其裂解效果，制備高濃度N1菌液分別投放至淡水紅鯉魚（red carp）和海水仿刺參（）養殖水體，采用細菌平板計數法及PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術分析48 h內水體環境中細菌、弧菌總數及細菌群落結構變化。經鑒定蛭弧菌N1為噬菌弧菌，其對大腸桿菌（）、溶藻弧菌（）、黃海希瓦氏菌（）、燦爛弧菌（）、哈氏弧菌（）和金黃色葡萄球菌（）均有裂解效果。將噬菌弧菌N1投放進淡水和海水養殖環境的12~24 h，其能顯著降低兩種環境中弧菌含量（< 0.05）。DGGE分析顯示添加噬菌弧菌N1后淡水組優勢菌群弧菌屬（，a1）和不可培養桿菌屬（Uncultured bacterium, a5）在 12 h 以后含量有明顯的減少，假單胞菌屬（, a3）和紅桿菌科屬（, a6）菌含量增加。海水組優勢菌群不可培養桿菌屬（c2）菌在 12 h 時變成非優勢菌群，而白桿菌屬（，c1）增加成為優勢菌群。噬菌弧菌N1在水中含量在24 h時降至最低。噬菌弧菌N1對海水和淡水環境中的弧菌屬和不可培養桿菌屬菌群有明顯的裂解作用導致其含量下降，但也使假單胞菌屬（），紅桿菌科屬和白桿菌屬（）菌群含量增加，但生物效應不明。為維持噬菌弧菌N1對弧菌的控制，需要24 h左右重新補充投放。

噬菌弧菌N1；養殖水體；PCR-DGGE分析；細菌群落；弧菌；不可培養桿菌屬

蛭弧菌及其類似物（-and-like organisms，BALOs），簡稱蛭弧菌，是一個革蘭陰性（G-）細菌類群，菌體呈弧狀或短桿狀，具有寄生性，能夠裂解一些革蘭陰性（G-）細菌，如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、幽門螺旋桿菌等[1]。蛭弧菌包括蛭弧菌科（Bdellovibrionaceae）和噬菌弧菌科（Bacteriovoracaceae），噬菌弧菌科分噬菌弧菌屬（，Ba）和吞菌弧菌屬（，Per）。蛭弧菌普遍存在于環境中[2-4]，對環境微生物群落結構產生影響。

在水產養殖領域，隨著我國高密度規模化養殖方式的普及，水產細菌性病害問題日益凸顯，抗生素等藥物的濫用導致藥物殘留加重，對食品安全問題造成威脅，直接對水產養殖業造成嚴重經濟損失[5-6]。蛭弧菌因其特有的裂解特性、廣泛的分布及種類繁多等優點，在生物防治領域具有一定的應用價值[7-9]。在應用蛭弧菌防治細菌性疾病上，早期Nakamura等[10]利用蛭弧菌治療弗氏志賀菌（）感染的兔眼角結膜炎。Nayak等[11]報道噬菌蛭弧菌成功防治稻田水中由黃單胞菌（）引起的水稻白枯病的。國內關于蛭弧菌防治的研究在水產養殖應用方面報道較多，如應用淡水蛭弧菌防治嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌等取得一定得成效[12-13]。目前國內外對噬菌弧菌的研究主要集中在其裂解機制方面[14-15]，及對凡納濱對蝦弧菌病的防治問題[16]，但噬菌弧菌對環境微生物群落結構影響目前尚未見報道。本研究主要以淡水（紅鯉魚）養殖環境和海水（仿刺參）養殖環境為實驗條件，利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術研究了噬菌弧菌N1在一個投放周期內對淡水紅鯉魚水體和海水刺參養殖水體中細菌群落結構的影響，以期了解噬菌弧菌N1在淡水和海水養殖的實際應用效果，為噬菌弧菌的細菌性疾病防治應用開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參，體長10 cm左右，體質量12 g左右，取自農業部北方海水增養殖重點實驗室；紅鯉魚苗，體長5 cm左右，購于觀賞魚市場，且產地均為遼寧省大連市。

噬菌弧菌N1（sp. N1）分離自市售微生態制劑（淡、海水均適用）。

1.2 方法

1.2.1 蛭弧菌的分離及裂解能力測試

1.2.1.1 蛭弧菌的分離純化 樣品預處理：將蛭弧菌微生態制劑用0.45 μm微孔濾膜粗過濾以除去大部分雜菌和顆粒物質，濾出液經0.22 μm微孔濾膜收集蛭弧菌菌體。由生理鹽水洗脫懸浮備用。

蛭弧菌的分離：將大腸桿菌作為宿主菌（）進行擴大培養，吸取1 mL宿主菌和0.5 mL樣品混合后加入4 mL冷卻至40~50 ℃的質量分數0.7%瓊脂培養基中，均勻混合后，立即灌注到預先制備的質量分數1.5%瓊脂平板上，待凝固后于28 ℃正置培養3~5 d。

蛭弧菌的純化：取單一噬菌斑以大腸桿菌為宿主菌在28 ℃、160 r/min進行搖床擴大培養48 h。同分離培養方法，再次雙層瓊脂平板培養，培養3次以上直到平板上出現形態一致的噬菌斑。將純化后蛭弧菌培養液在4 ℃、3 000 r/min低速離心15 min，上清中即含有大量蛭弧菌細胞，該純化菌命名為蛭弧菌N1。蛭弧菌濃度測定采用計數噬菌斑法獲得。

1.2.1.2 蛭弧菌N1 16S rDNA序列擴增及序列分析 以噬菌蛭弧菌16S rDNA區特異性引物Bac676F和Bac1442R進行擴增。PCR反應體系（50 μL）：10×DNA buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，引物（10 μmol/L）2 μL，模板DNA 5 μL，Taq酶（2.5 U/μL）0.5 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；53 ℃，30 s；72 ℃，30 s； 40個循環；72 ℃，7 min。PCR產物進行送樣測序，測序結果用NCBI數據庫的Nuclotide BLAST進行比對分析。

1.2.1.3 蛭弧菌N1裂解能力的測試 用實驗室保存的6株菌作為宿主菌進行分離蛭弧菌裂解能力的測試。革蘭氏陰性菌有大腸桿菌（）、溶藻弧菌（）、黃海希瓦氏菌（）、燦爛弧菌（）、哈氏弧菌（），革蘭陽性菌為金黃色葡萄球菌（）。將大腸桿菌等革蘭氏陰性菌置于30 ℃恒溫搖床，將金黃色葡萄球菌置于37 ℃的恒溫搖床中培養，轉速160 r/min，培養16~24 h。將培養液在6 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清，沉淀用滅菌生理鹽水懸浮，4 ℃保存備用。采用雙層瓊脂平板法對分離的蛭弧菌進行裂解能力測試。每個宿主3個重復，記錄噬菌斑數量，并在結束時測量噬菌斑最大直徑。

1.2.2 蛭弧菌N1對淡水和海水養殖環境微生物的影響

1.2.2.1 實驗分組 實驗設置對照組、淡水組和海水組：淡水組養殖紅鯉魚（10尾），海水組（鹽度31~32）養殖仿刺參（10頭），兩組均添加50 mL純化的蛭弧菌N1菌液，致添加后終濃度為1×103PFU/mL，每個水槽注水量為50 L，實驗開始時（0 h）加入20 mL含2 g蛋白胨和0.5 g酵母粉的無菌營養液[17]，對照組不添加噬菌弧菌N1菌液，所有組均2個平行。室內養殖，保證溫度一致（25 ℃左右），每個水槽放置一個氣石，暫養期為7 d，不換水，實驗期為48 h。

1.2.2.2 樣品采集和處理 在添加蛭弧菌N1菌液前30 min內采集第一次水樣，即0 h時刻，加入蛭弧菌N1后4、12、24、48 h分別采集水樣1 L。所有水樣均在當天處理完成：各取500 mL水樣用0.22 μm微孔濾膜在無菌條件下抽濾，無菌勺刮取濾膜上的菌體，并用TE緩沖液沖洗，溶于總計4 mL緩沖液中，用于總細菌、弧菌和蛭弧菌的計數，剩余樣品-20 ℃保存備用，用于DNA的提取。

1.2.2.3 微生物計數 將過濾收集的細菌進行梯度稀釋，計數總細菌數量時，海水樣品采用2216E固體平板培養，淡水樣品采用NB固體培養基培養。弧菌計數則用TCBS培養基檢測。蛭弧菌計數用雙層自來水瓊脂平板進行計數。以上各稀釋梯度樣品均設置兩個重復。

1.2.2.4 水環境中細菌基因組DNA提取 取適量樣品于12 000 r/min離心10 min，取沉淀，加入180 μL溶菌酶充分混勻，置于37 ℃水浴鍋溫浴30 min，使用細菌基因組DNA提取試劑盒篇[天根生化科技（北京）有限公司]提取基因組DNA。取5 μL DNA樣品用10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余存于-20 ℃備用。

1.2.2.5 16S rDNA V3 區擴增及變性梯度凝膠電泳（DGGE） 分別提取的五批次40個樣品（編號1-40）總基因組DNA作為模板，用V3區特異性引物進行PCR擴增，選擇細菌16S rRNA V3區引物357F-40GC5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）作為引物[18]，擴增產物片段大小約為230 bp。使用Bio-Rad DcodeTM system（Bio-Rad ）對16S rDNA PCR擴增產物進行DGGE分析。在變性梯度為30% ~ 60%的質量分數8% 聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的質量比為 37.5∶1）上，電泳5 h。凝膠成像儀上拍照，分析V3區電泳條帶差異。

對DGGE中部分優勢電泳條帶通過無菌刀片切膠回收、純化，純化產物分別用 pEASY-T1 載體連接，轉化DH5α，每個條帶各選取2個陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序引物M13F-47和M13R-48。

1.2.2.6 數據分析 PCR-DGGE圖譜采用Quantity One（Bio-Rad）軟件分析。將優勢條帶和變化明顯的條帶割膠回收后進行測序，測序所得的16S rDNA序列經GenBank數據庫比對分析給出結果。

2 結果與分析

2.1 蛭弧菌N1分離與鑒定

蛭弧菌N1在雙層瓊脂平板上生長48 h后形成清晰可見的圓形噬菌斑，30 ℃培養4 d之后菌斑直徑可達4 ~ 5 mm（圖1所示）。PCR擴增產物測序分析得知，N1的16S rDNA基因片段大小為766 bp，測序結果表明N1菌株為噬菌弧菌屬菌株，與JS5具有95 %的相似性，命名為噬菌弧菌N1（sp. N1）。

2.2 噬菌弧菌N1的裂解能力

實驗表明，噬菌弧菌N1對選取的6株宿主菌均有較好的裂解能力，除大腸桿菌外，最大噬菌斑直徑均可達到4 mm，且出斑時間短，在24 ~ 48 h即可形成清晰可見的噬菌斑，最大噬菌斑直徑達4.5 mm，見表1。裂解效價為哈氏弧菌最高，達到了600 PFU/mL，最小的為燦爛弧菌，裂解效價為188 PFU/mL。

a，純化前噬菌斑；b，純化后噬菌斑

表1 Bacteriovorax sp. N1對不同宿主菌的裂解效價

2.3 噬菌弧菌N1對淡水和海水養殖水體微生物總量的影響

淡水組中，實驗組和對照組中總可培養細菌總含量和弧菌含量的變化趨勢較一致。弧菌含量在0 ~ 4 h呈迅速上升趨勢，隨后含量逐漸減少至峰值的一半，在第24 h后又趨于增長趨勢，實驗組弧菌含量在12、24 h顯著低于對照組（< 0.05）（圖2a）。實驗組中蛭弧菌含量變化明顯，在0 ~ 4 h時由初始濃度1×103PFU /mL增長至1.5×104PFU /mL，而隨后含量持續降低，到24 h時降低到8×103PFU /mL，到48 h幾乎檢測不到（圖2 b）。總可培養細菌含量在第1 d內迅速增長，在第24 h時達到峰值，在第2 d內含量逐漸下降至接近初始水平，兩組間差異不顯著（0.05）（圖2 c）。

海水組中，實驗組和對照組總可培養細菌數和弧菌數變化趨勢較一致。實驗組弧菌含量也在12、24 h顯著低于對照組（< 0.05）（圖3d）。蛭弧菌含量變化趨勢與淡水組基本一致，但是蛭弧菌濃度高于淡水環境，最高可達2.5×104PFU /mL，而且在48 h后水中蛭弧菌的含量可達到8×103PFU /mL（圖3e）。可培養細菌總數在48 h內總體呈增長趨勢，實驗組在12 ~ 24 h之間有明顯下降趨勢（< 0.05），弧菌含量也有此現象（< 0.05）（圖3f）。

綜上分析可知，添加噬菌弧菌N1菌液會使淡水和海水養殖水體中異氧細菌和弧菌含量有所下降，表現為具有一定的防控作用，但對弧菌的防控效果顯示在24 h效果顯著。

a為弧菌數；b為蛭弧菌數；c為可培養總細菌數

a為弧菌數；b為蛭弧菌數；c為可培養總細菌數

2.4 淡水及海水環境中基因組DNA提取和PCR擴增

PCR擴增結果經質量分數2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，40個樣品均得到大小為200 bp左右的擴增基因片段，且條帶較亮。

2.5 PCR-DGGE分析噬菌弧菌N1對海水和淡水養殖環境細菌群落的影響

DGGE分析結果如圖4、5所示。DGGE圖譜上不同條帶代表不同的微生物種類，條帶亮度大小代表微生物相對數量的多少，越亮則代表微生物數量越多。由圖4、5可以看出，添加噬菌弧菌N1后不同取樣時間淡水組實驗組和海水實驗組條帶較對照組均存在一定的差異。淡水組和海水組DGGE顯示優勢條帶（a1 ~ a6, c1 ~ c2）和部分差異條帶（b5, d1）被切膠回收和克隆測序，結果見表2，主要變化的微生物群落有弧菌屬（）、不可培養桿菌屬（uncultured bacterium）、假單胞菌屬（）、紅桿菌科屬（）等。

隨著時間的延長淡水實驗組菌群豐度下降較明顯，而對照組基本維持在同一水平；淡水組加入噬菌弧菌N1后與加入噬菌弧菌N1前（0 h）菌群數量及優勢類群出現部分差異變化。0 h和4 h以弧菌（, a1）和不可培養桿菌屬（uncultured bacterium, a5）為主要優勢類群，在12、24、48 h時這兩個優勢類群有明顯的減少，弧菌屬（a1）甚至變為非優勢類群，隨之新增了假單胞菌屬（, a3）和紅桿菌科屬（, a6）為優勢類群。在4 h時新增的差異條帶b5經測序檢測為噬菌弧菌N1，但因含量較低，在12 h之后不再有明顯可見的條帶出現。在24 h時實驗組微生物菌群豐度值達到最低，即菌群數量最少。

海水實驗組和對照組隨時間變化其微生物群落豐度值逐漸增加后回落。海水組微生物菌群結構除部分優勢類群有一定變化，其他非優勢類群變化較少。白桿菌屬（，c1）在0 h和4 h并不完全是優勢類群，而在12 h及之后以絕對優勢菌群存在，不可培養桿菌屬（uncultured bacterium, c2）在0 h為主要的優勢菌群，在12 h時變成非優勢菌群，隨后又成為優勢菌群。d1經檢測為噬菌弧菌N1，且因為含量較低，在之后并沒有明顯條帶出現。其他非優勢類群在海水實驗組和對照組中數量均有所增加，而沒有出現如淡水實驗組中明顯減少現象。

a1―a6為優勢菌群；b1―b10為差異菌群

a1―a6 are dominant microflora; b1—b10 are different from microflora

圖4 噬菌弧菌N1對淡水組水體細菌菌群結構影響的DGGE分析及電泳識別

Fig. 4 DGGE of the effect of Bacteriovorax sp. N1 on bacterial community structure in freshwater

c1，c2是優勢菌群；d1―d5是差異菌群

c1, c2 are dominant microflora; d1―d5 are different from microflora

圖5 噬菌弧菌N1對海水組水體細菌菌群結構影響的DGGE分析及電泳識別

Fig. 5 DGGE of the effect of Bacteriovorax sp. N1 on bacterial community structure in seawater

表2 DGGE回收條帶序列分析

3 討論

蛭弧菌對環境細菌數量、群落結構和豐度的影響主要取決于蛭弧菌裂解特性[19-23]。水產養殖環境中大多數病原菌都是革蘭氏陰性菌，有研究[24]報道蛭弧菌更易裂解環境中的弧菌。本研究主要研究噬菌弧菌N1在一個投放周期內對養殖環境中的微生物總數及群落結構或豐度的影響，DGGE結果顯示淡水組加入噬菌弧菌N1后菌群數量及優勢類群出現部分差異變化，原優勢群落弧菌屬（，a1）和不可培養桿菌屬（uncultured bacterium, a5）12 h后有明顯的減少，弧菌（a1）甚至變為非優勢類群，該結果與平板培養結果一致，而增加了假單胞菌屬（，a3）和紅桿菌科屬（, a6）兩個優勢類群。海水組的優勢菌群不可培養桿菌屬（uncultured bacterium, c2）在12 h后明顯減少，在24 h后又恢復為優勢菌群，而白桿菌屬（A）在12 h后增加成為優勢菌群。平板培養實驗顯示噬菌弧菌N1對海水中的弧菌也有較明顯的裂解效果，尤其是12~24 h，實驗組弧菌含量顯著下降（< 0.05），但在DGGE實驗中沒有發現這一現象，原因可能是在該海水養殖環境中弧菌還未形成優勢菌群，因此在分析中忽略了弧菌條帶的變化。綜合16S rDNA V3區擴增及DGGE分析可知，噬菌弧菌N1主要對弧菌和不可培養桿菌屬等細菌具有明顯的裂解作用致其含量下降。溫崇慶等[25]關于噬菌弧菌DA5對對蝦池育苗水體中細菌群落結構變化的研究表明較高含量的DA5在一定時間內對育苗水體中的弧菌和異養細菌有較明顯的削減效果，這與本研究所得結果具有一致性。

本研究發現噬菌弧菌N1也可使淡水中假單胞菌屬（）和紅桿菌科屬微生物含量增加，使海水中的白桿菌屬（）細菌含量增加，而這些微生物對養殖動物的生物學效應還需要進一步研究。尤其假單胞菌屬的部分種在一定條件下具有致病性，噬菌弧菌N1作為微生態制劑應用在紅鯉魚養殖環境中，假單胞菌屬菌含量增加引起的效應還屬未知，因此噬菌弧菌N1的長期微生物環境效應需要進一步研究。此外，本研究中噬菌弧菌N1在24 h時數量降至最低，因此施用頻率應該為每24 h補充一次噬菌弧菌N1，才能較好得使噬菌弧菌N1對弧菌的控制效應得以累積。

單一蛭弧菌的裂解范圍是有限的，而養殖水體中微生物菌群結構復雜，因此可選用不同裂解范圍的蛭弧菌混合使用，可能會達到協同作用效果[26]。蛭弧菌也可與其他諸如增加營養，改善水質或增強免疫等的功能菌組合使用，以實現多目的同時進行，優勢互補。水體中微生物群落結構的研究準確性很大程度上依賴于方法和技術的進步[27]。DGGE能夠直觀的比較和分析微生物群落結構、豐度變化規律，但分析圖譜只能反映可視條帶的數量和變化，對含量極低的群落很難呈現出來，對這部分微生物影響的研究可用高通量測序的方法進行。此外，噬菌弧菌N1對養殖環境中水質指標的影響，以及其與微生物群落變化間的關系還需要進行進一步的研究，本文研究了一個施用周期噬菌弧菌N1對環境微生物群落的影響，而其長時間施用對環境乃至刺參腸道微生物群落組成及功能的影響也需要考慮。

[1] DWIDAR M, MONNAPPA A K, MITCHELL R J. The dual probiotic and antibiotic nature of[J]. BMB Reports, 2012, 45(2): 71-78.

[2] DAVIDOV Y, JURKEVITCH E. Diversity and evolution of-and-like organisms (BALOs), reclassification ofasgen. nov., comb. nov., and description of theclade as. nov.[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004, 54(5): 1439-1452.

[3] 韓民泳, 陳慧黠, 斯晗, 等. ARDRA分型測定刺參養殖環境中蛭弧菌多樣性[J]. 微生物學通報, 2016, 43(2): 254-261.

[4] 韓民泳, 陳慧黠, 斯晗, 等. 刺參消化道中蛭弧菌類的生物多樣性分析[J]. 微生物學雜志, 2015, 36(1): 44-48.

[5] 趙玲敏, 左妍斐, 黃力行. 水產健康養殖中病害防控研究進展[J]. 安徽農業科學, 2018, 46(28): 18-21; 52.

[6] HAO R Z, ZHAO R T, QIU S F, et al. Antibiotics crisis in China[J]. Science, 2015, 348(6239):1100-1101.

[7] DEFOIRDT T, SORGELOOS P, BOSSIER P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture[J]. Current Opinion in Microbiology, 2011, 14(3): 251-258.

[8] SARA R, Bacterial arms race revs up[J]. Nature, 2015, 521(7553): 402-403.

[9] ELIZABETH S R, GAREY L.as therapeutic agents: a predatory renaissance[J]. Nature Reviews Microbiology, 2004, 2(8): 669-675.

[10] NAKAMURA M. Alteration of Shigella pathogenicity by other bacteria[J]. The American Journal of Clinical Nutrition. 1972, 25(12): 1441-1451.

[11] NAYAK N, PANI B K, DAS S R. Biological control of bacterial blight of rice (pv) by[J]. Research in Plant Disease, 2002, 17(2): 381-383.

[12] 李永文, 朱文漓, 顧繼銳, 等. 大口鯰病原菌蛭弧菌的分離及其生物學特性研究[J]. 淡水漁業, 2006, 36(2): 9-12.

[13] CAO H, HOU S, HE S, et al. Identification of asp. isolate as a potential biocontrol bacterium against snakehead fish-pathogenic[J]. Journal of Fish Diseases, 2014, 37(3): 283-289.

[14] KANESHIRO E S, HUNT S M, WATANABE Y.proliferation and predation without sphingophosphonolipids[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 367(1): 21-25.

[15] JAYASIMHULU K, HUNT S M, KANESHIRO E S, et al. Detection and identification ofUKi2 sphingophosphonolipid molecular species[J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2007, 18(3): 394-403.

[16] WEN C Q, XUE M, LIANG H F, et al. Evaluating the potential of marinesp. DA5 as a biocontrol agent against vibriosis inlarvae[J]. Veterinary Microbiology, 2014, 173(1/2): 84-91.

[17] 溫崇慶, 丁賢, 薛明, 等. 一株海洋蛭弧菌類生物對海水細菌的生物控制和水質的影響[J]. 中山大學學報（自然科學版）, 2008, 47(3): 85-88.

[18] MUYZER G, DE WAAL E C, UITIERLINDEN A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16SrRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(3): 695-700.

[19] 陸友云, 溫崇慶, 李志樺, 等. 不同感染復數下海洋蛭弧菌 DA5 對溶藻弧菌的控制效率[J]. 廣東海洋大學學報, 2018, 38(2): 30-36.

[20] KOVAL S F, BAYER M E. Bacterial capsules: no barrier against[J]. Microbiology, 1997, 143: 749-753.

[21] YAIR S, YAACOV D, SUSAN K, et al. Small eats big: ecology and diversity ofand like organisms, and their dynamics in predator-prey interactions[J]. Agronomie, 2003, 23(5/6): 433-439.

[22] ROGOSKY A M, MOAK P L, EMMERT E A. Differential predation by109J[J]. Current Microbiology, 2006, 52(2): 81-85.

[23] SCHOEFFIELD A J, WILLIAMS H N. Efficiencies of recovery offrom brackish-water environments by using various bacterial species as prey[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1990, 56(1): 230-236.

[24] WILLIAMS F N, PI?EIRO S. Ecology of the predatory-and-like organisms[J]. E. Jurkevitch Predatory Prokaryotes.: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2007, 4: 213-248.

[25] 溫崇慶, 梁華芳, 丁賢, 等. 海洋蛭弧菌類生物 DA5 對凡納濱對蝦育苗期幼體和水質的影響[J]. 熱帶海洋學報, 2010, 29(6): 147-152.

[26] 陳康勇, 鐘為銘, 高志鵬. 蛭弧菌在水產養殖中應用研究進展[J]. 水產科學, 2018, 37(2): 283-288.

[27] 夏圍圍, 賈仲君. 高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術評價[J]. 微生物學報, 2014, 54(12): 1489-1499.

Effect ofsp. N1 on the Bacterial Community in the Freshwater and Seawater Environment Using PCR-DGGE

CHEN Hui-xia1，HAN Min-yong1，YU Jia-hao1，LIU lin2

（1.,,,, 116023. 2.,,,266109,）

【】To study the effects ofsp. N1 on the total number of bacteria, Vibrio and bacterial community structure within an addition cycle in seawater and freshwater aquaculture environments. 【】N1 was isolated from commercially available microecological preparations. Molecular identification was carried out and its lysis effect was preliminarily determined. In addition, high concentration of N1 strain was splashed evenly into freshwater tank and seawater tank containing the red carprespectively. The number of bacteria, Vibrio and structure of bacterial community in the water environment within 48 h were analyzed by plate counting and Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE) respectively.【】The strain N1 was identified assp.. It had lysis effect on,,,,and. WhenN1 was added to the fresh and marine culture environments for 12―24 hours, the content of Vibrio in both environments was significantly reduced (< 0.05). Results from DGGE showed that by addingsp. N1, the dominant(a1) and uncultured bacterium (a5) counts decreased significantly after 12 h in freshwater group, but(a3) and(a6) counts were increased. The dominant bacterium uncultured bacterium (c2) became a non-dominant species after 12 h in the seawater group, however,(c1) has become the new dominant bacterium. The content ofsp. N1 decreased to the lowest level within 24 hours. 【】sp. N1 can split Vibrio, uncultured bacterium, and also increase the number of microflora of,andin freshwater and seawater aquaculture environment. At present, the biological effects of these newly increased microflora are not known. In order to control the outbreak of Vibrio in fish cluture,sp. N1 should be replenished in 24 hours.

sp. N1; aquaculture environment; PCR-DGGE analysis; bacterial community; vibrio; uncultured bacterium

Q939.99

A

1673-9159（2019）05-0008-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.002

2019-05-07

遼寧省教育廳計劃項目（L2012255）

陳慧黠（1980－），女，博士，講師，研究方向為微生物學及微生物應用。E-mail：chenhuixia@dlou.edu.cn

劉琳（1979－）女，博士，講師，研究方向為微生物應用。E-mail：liulin@qau.edu.cn

陳慧黠，韓民泳，于佳豪，等. 噬菌弧菌N1對淡水和海水養殖水體細菌群落影響PCR-DGGE分析[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（5）：8-15.

（責任編輯：劉朏）