羅湖病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

吳鳳雷，黃瑜，黃郁蔥，蔡雙虎，簡紀常，湯菊芬

羅湖病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

吳鳳雷，黃瑜，黃郁蔥，蔡雙虎，簡紀常，湯菊芬

（廣東海洋大學水產學院, 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室暨水產經濟動物病害控制廣東省普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【】建立一種快速、靈敏、特異的羅非魚（spp）羅湖病毒定量檢測方法。根據羅湖病毒節段8保守區設計一對特異性引物，建立檢測羅湖病毒的SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR方法，并對該方法的特異性、靈敏度和重復性進行了評價。標準曲線在2.5×108～2.5×100拷貝數之間有良好的線性關系（相關系數2= 0.999），檢測限為2.5×100個拷貝。試驗內及試驗間變異系數分別為0.11%～0.43%與0.54%～1.13%，重復性強；對水生動物其他病毒和細菌均無擴增反應，有很好的特異性。新建立的羅湖病毒實時熒光定量PCR檢測方法特異性好、靈敏度高、重復性強，可用于TiLV的早期的快速診斷、流行病學調查和防控。

羅非魚；羅湖病毒；檢測；實時熒光定量RT-PCR；標準曲線

尼羅羅非魚（）又稱白色三文魚，是全球重要淡水養殖經濟魚種之一，有繁殖力強、生長速度快、產量高和抗病力強等優點[1]，是聯合國糧食及農業組織（FAO）推薦養殖魚種。近年來，以色列、厄瓜多爾、哥倫比亞、泰國和埃及等國及中國臺灣養殖和野生的羅非魚相繼暴發一種新病害[2-4]，導致巨大的經濟損失，引起國際上的廣泛關注。該病主要癥狀為病魚消瘦，體色發黑，眼球突出渾濁，體表充血、潰爛，腹部膨脹有積水。經研究證實，導致以色列羅非魚大量死亡的病原體是一種新型RNA病毒[5]——羅湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV）。羅湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV）是一種新型的正黏病毒，由10個獨特的基因節段組成，最大的節段1包含1個開放閱讀框，與C型流感病毒PB1同源性較低，其他9個節段在GenBank中未發現與任何核酸、蛋白同源序列。最近研究發現，羅湖病毒還可感染與發病羅非魚同池的 施氏高體鲃（）[6]，對其他魚類同樣造成了嚴重威脅。因此，開展羅湖病毒的快速檢測和防控技術研究尤為重要和迫切。

迄今已有病毒分離細胞培養[7-8]、原位雜交和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）[9-10]等多種檢測方法用于診斷TiLV。細胞培養和原位雜交操作過程復雜、耗時，并且需要專業技術人員進行測定，且結果不確定，常延誤病情的診斷；一步RT-PCR和巢式RT-PCR雖有較高的靈敏度和特異性，但檢測過程繁瑣且無法實現實時定量的監控檢測和樣品之間的比較，難以掌握病情的發生和發展進程。實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）具有操作簡單、靈敏度高和特異性強等優點，整個反應過程一步完成，無需對反應產物進行后期處理，大大避免了后期污染和假陽性的發生，提高了檢測效率及準確性，已越來越多地應用于水生動物病原檢測[11-12]。本研究旨在建立一種可檢測TiLV的實時熒光定量RT-PCR檢測方法，為TiLV的早期快速診斷、流行病學調查提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用吉富羅非魚購自茂名高州某養殖公司，羅湖病毒由本研究室保存。

主要試劑Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、pMD18-T 載體和反轉錄試劑盒均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司；RNA 提取試劑盒、One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒、Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒和大腸桿菌（）DH5α 感受態細胞，購自北京全式金生物技術有限公司。

主要儀器實時熒光定量 PCR儀（Light Cycler 96）、梯度PCR儀（S1000）、核酸定量儀（ND2000）均由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 應用DNAMAN軟件對GenBank上已登錄的羅湖病毒節段8節段進行比對分析，在保守區域設計一對特異引物：正向引物TiLV-F，5′-ATTCGTCCCAGCCTTTCCTC-3′；反向引物TiLV-R，5′ -GATTTCACGCTCAACGGCAT-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司（下簡稱“生工公司”）合成。

1.2.2 RNA的提取及cDNA一鏈的合成 按Trizol說明書提取病毒總RNA。通過凝膠電泳檢測總RNA完整性，用核酸定量儀檢測總RNA濃度和純度。用One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒按照說明書合成cDNA一鏈，于-20℃保存待用。

1.2.3 DNA片段的克隆與標準品的制備 以反轉的cDNA一鏈為模板和引物TiLV-F/TiLV-R擴增目的片段，反應條件：94 ℃4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環；72 ℃5 min，4 ℃下保存。PCR 反應產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收后，與pMD-18T連接構建重組質粒，將重組質粒轉化DH5α，陽性克隆送至生工公司測序。將含有目的條帶、經測序確認的陽性克隆大量培養后，用Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取重組質粒DNA，并用核酸分析儀測定重組質粒DNA的質量濃度。按照公式：質粒濃度( 拷貝/μL) = 6.02×1023(拷貝/mol) × 質粒質量濃度(g/μL) / 質粒分子數，換算出重組質粒濃度，將含有TiLV目的片段的重組質粒作為標準品。

1.2.4 靈敏度試驗及標準曲線的繪制 通過對實時熒光定量PCR反應體系中最佳退火溫度（生工公司設計合成上下游引物推薦平均值）和引物濃度（熒光定量酶推薦引物濃度），最終確定反應體系為：2×One StepRT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL，Ex TaqHS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5 μL，模板及引物各1 μL，滅菌ddH2O補足25 μL。反應程序：94 ℃ 3 min；94℃ 15 s，57 ℃15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。將重組質粒進行10倍系列梯度稀釋，共9個濃度梯度，分別為2.5×108～2.5×100拷貝/μL，進行qRT-PCR擴增，每個濃度梯度設3個重復。PCR結束后，利用Excel軟件進行數據分析，包括查看擴增曲線和循環數。計算重組質粒不同稀釋梯度與循環數的相關性，繪制標準曲線[13]，并建立回歸方程，用于定量分析。以每個濃度梯度重組質粒平均循環數為橫坐標，各濃度梯度質粒模板濃度的對數值為縱坐標。

1.2.5 特異性實驗 分別以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（）、無乳鏈球菌（）、海豚鏈球菌（）、嗜水氣單胞菌（）、乳酸乳球菌（）、腫大細胞虹彩病毒和神經壞死病毒（均由本實驗室分離保存）等多種菌毒株的DNA為模板，進行實時熒光定量RT-PCR擴增，用無菌ddH2O作為陰性對照，觀察結果確定引物特異性。

1.2.7 臨床樣品的檢測 取TiLV采用注射法回歸感染不同批次的吉富羅非魚（50 ~ 100 g，健康，28℃養殖），共采集魚3批次25尾，抽檢7尾，提取各組織總RNA和合成cDNA鏈，分別利用1.2.4中建立的實時熒光定量PCR方法進行檢測，比較分析結果。根據樣品循環數和擴增曲線綜合判定：無擴增曲線的判為陰性樣品；循環數≤37.96，且擴增曲線呈“S”型者判為陽性；循環數≤37.96，但擴增曲線不規則或為陡直斜線者判為陰性；循環數> 37.96者為陰性。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

以TiLV cDNA 為模板進行RT-PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得單一的203 bp目的條帶，與預期大小相同（圖1）。目的片段序列用Blast程序進行同源性比較和相似性分析，結果顯示與TiLV泰國株（KU751821）節段8的同源率高達97.5%，擴增產物確證為TiLV節段8的部分序列。

M. DL500 DNA 分子標記；1. TILV 節段8部分序列

2.2 引物特異性

由圖2可知，經qRT-PCR擴增，僅以TiLV反轉錄cDNA為模板出現典型的“S”型擴增曲線，而以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌、乳酸乳球菌、腫大細胞虹彩病毒的DNA和神經壞死病毒為對照模板時，出現不規則的折線形，而不是“S”型擴增曲線。由圖3可知，不同濃度標準品進行定量熒光PCR，對其擴增產物作熔解曲線分析時，均只在熔解溫度（82.53±0.1）℃處有一個特異性吸收峰，無其他非特異性雜峰。表明所設計引物有良好的特異性。

曲線1為TiLV，其余分別為神經壞死病毒、腫大細胞虹彩病毒、無乳鏈球菌、大腸桿菌、海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、乳酸乳球菌DNA

圖3 TiLV節段8熔解曲線

2.3 標準曲線和靈敏度

經測定，提取的重組質粒起始質量濃度為80.64 ng/μL，經換算，重組質粒為2.5×1010拷貝/μL。以10倍系列稀釋后重組質粒為標準品進行qRT-PCR，結果如圖4所示，以2.5×108～2.5×100拷貝/μL 9 個濃度梯度質粒作為模板得到的擴增曲線呈典型的“S”型，隨著模板量的減少，其對應的循環數相應增加，兩者之間具有良好的線性關系。

根據RT-PCR實驗要求擴增效率應處于90% ~ 110%之間，相關系數2等于0.999，符合RT-PCR要求，在實時熒光定量 PCR 方法所允許的誤差范圍內。

由標準曲線圖可知，本研究開發的熒光定量檢測技術最低檢測限達2.5拷貝數，靈敏度較高。

從左到右依次（1 ~ 9）為重組質粒拷貝數為2.5×108~ 2.5×100

圖5 定量PCR的標準曲線

2.4 重復性

用6種濃度的質粒標準品分別進行批內和批間重復性實驗，結果表明，批內和批間重復性實驗變異系數（CV）均< 2%（表1），表明該方法有良好的重復性與穩定性。

2.5 臨床樣品的檢測

應用所建立的qRT-PCR檢測方法對25份已攻毒臨床病魚進行檢測，并與常規的RT-PCR作對比。抽檢7尾魚PCR擴增結果（圖6、圖7）顯示，qRT-PCR法與常規RT-PCR均檢測到陽性樣品5條，qRT-PCR方法與常規RT-PCR方法檢測結果一致。

表1 TiLV實時熒光定量批內和批間重復性實驗

說明：= 3

M：DL2000 DNA分子標記；1~7，取樣標號

圖7 攻毒魚抽檢熒光定量PCR擴增曲線

3 討論

羅湖病毒自2009年首次在以色列發現以來，已經相繼在厄瓜多爾、哥倫比亞、泰國、埃及、我國臺灣地區、印度和馬來西亞等多個國家或地區得到確認[14]，目前還有進一步傳播到其他地區的趨勢，已經成為危害國內外羅非魚養殖產業的重要病原。目前，由于對羅湖病毒病尚無有效的防治措施，其發病癥狀與氣單胞菌感染癥狀相似，因此，快速、準確、靈敏的早期診斷對羅湖病毒病的預警預報與防控具有重要的意義。

與傳統的細胞培養、原位雜交和RT-PCR檢測方法相比，實時熒光定量PCR檢測技術具有快速、靈敏度高、特異性強和定量組織樣品中的病原體的優勢，已被開發并驗證用于檢測其他魚類病毒[15-16]，例如使用熒光定量PCR檢測含有淋巴囊腫病毒的無癥狀載體金頭鯛（）[17]和舌齒鱸（）[18]中神經壞死病毒的組織分布和靶器官組織中的病毒復制。以前的研究顯示，標準RT-PCR方法的檢測限為70 000個病毒拷貝，而更敏感的巢式RT-PCR在魚組織中檢測到低至7個拷貝[19]。本研究建立基于羅湖病毒節段8的實時熒光定量PCR檢測技術，該技術對于檢測臨床樣品中的TiLV具有高度敏感性和特異性，最低檢測限可以檢測低至2.5拷貝/μL，其檢測靈敏度是常規RT-PCR的100倍，與已報道的探針檢測靈敏度相當[20]。

SYBR Green I是一種能結合到雙鏈DNA小溝部位并發出熒光的染料，在PCR反應中任何的非特異性擴增都會影響結果的準確性。本意見所建立的用于檢測TiLV的SYBR Green I實時熒光定量PCR 方法呈現出良好的S型擴增曲線，只出現特異擴增產物的單峰，產物的m值均一，表明無引物二聚體及非特異性擴增產物出現；特異性反應實驗結果只出現單一特異性條帶，與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌、乳酸乳球菌和腫大細胞虹彩病毒均無交叉反應，表明其具有良好的特異性。由標準曲線可見，該方法起始模板濃度與循環數之間呈良好的線性關系，直線回歸方程的相關系數可達0.999（> 0.95），批內和批間差異系數分別為0.11% ~ 0.43%和0.54% ~ 1.13%。這些數據與先前的熒光定量PCR方案在其他魚類病毒中的范圍相當[21-22]，說明建立的反應體系具有很高的精確度和良好的穩定性。

本研究使用TiLV片段8的實時熒光定量PCR的方法，以TiLV部分基因序列建立檢測方法，為TiLV基因定量的有關研究提供參考，對早期羅湖病毒的快速檢測以及羅非魚羅湖病毒的預防及用藥治療提供技術支持。

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Development of Real-time Fluorescence Quantitative RT-PCR Detection Method for Tilapia Lake Virus

WU Feng-lei, HUANG Yu, HUANG Yu-cong, CAI Shuang-hu, JIAN Ji-chang, TANG Ju-fen

（,,524088,）

【】To establish a rapid, sensitive and specific quantitative detection method for Tilapia Lake Virus (TiLV).【】To design a pair of specific primers based on the conserved region of Lo Wu virus segment 8 and to establish SYBR Green I real-time quantitative RT-PCR for detection of TiLV. The specificity, sensitivity, and repeatability of the method were evaluated. 【】The standard curve had a good linear relationship between 2.5×108and 2.5×100copy number (correlation coefficient2= 0.999), and the detection limit was 2.5×100copy numbers. The intra- and inter-assay coefficients of variation were 0.11% - 0.43% and 0.54% - 1.13%, respectively. The repeatability was strong. There was no amplification reaction for other viruses and bacteria in aquatic animals, and it had good specificity. 【】The newly established real-time fluorescent quantitative PCR detection method of TiLV has good specificity, high sensitivity and high reproducibility, and can be used for early rapid diagnosis, epidemiological investigation, prevention and control of TiLV.

; Tilapia Lake Virus; detection; real-time fluorescence quantitative RT-PCR; standard curve

S943.125.41

A

1673-9159（2019）05-0031-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.005

2019-03-05

廣東省自然科學基金（2016A030313748）；國家重點研發計劃（2018YFD0900501）

吳鳳雷（1994―），女，碩士研究生，主要從事水產動物病害防治研究。E-mail: 2352289350@qq.com

黃郁蔥，副教授，主要從事水產動物免疫學及病害控制研究。E-mail: hyczjou@163.com

吳鳳雷，黃瑜，黃郁蔥，等. 羅湖病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（5）：31-37.

（責任編輯：劉慶穎）