禾谷鐮刀菌全基因組候選效應(yīng)因子預(yù)測(cè)與分析

張悅 施維 李丹

摘要：本研究根據(jù)已公布的禾谷鐮刀菌的全基因組信息，以其全基因組蛋白序列為試驗(yàn)材料，通過(guò)生物信息學(xué)方法，對(duì)其候選效應(yīng)分子及其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。首先利用SignalP、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor、TargetP等程序依次預(yù)測(cè)出其分泌類型的蛋白，再通過(guò)其序列大小和半胱氨酸的含量作進(jìn)一步篩選，最后利用Blastp工具與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有蛋白同源性的序列，從而獲得候選效應(yīng)分子。最終對(duì)禾谷鐮刀菌全基因組的14 038個(gè)蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)了126個(gè)符合條件的候選效應(yīng)分子。本研究通過(guò)LTR-FINDER程序?qū)坦如牭毒蚪M內(nèi)的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行分析，但未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子存在，值得進(jìn)一步分析研究。本研究采用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測(cè)出了禾谷鐮刀菌的候選效應(yīng)分子并查找其基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座子情況，可為進(jìn)一步研究這些效應(yīng)分子的功能，了解禾谷鐮刀菌進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：禾谷鐮刀菌;全基因組;候選效應(yīng)因子;轉(zhuǎn)座子;生物信息學(xué);致病機(jī)制;進(jìn)化歷程

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）屬半知菌類叢梗孢目瘤座孢科鐮刀屬菌。在糧食上普遍存在，它與其他幾種鐮刀菌都能引起小麥、大麥、玉米等作物發(fā)生赤霉病，還可以引起水稻、高粱、豆類、茭白等發(fā)生根腐病、莖基腐病、穗腐病。由鐮刀菌引起的赤霉病不僅會(huì)造成糧食產(chǎn)量減產(chǎn)，而且產(chǎn)生的真菌毒素也給人畜的健康造成了嚴(yán)重威脅[1-4]。

病原菌在入侵植物的過(guò)程中會(huì)分泌效應(yīng)分子到寄主植物細(xì)胞中，對(duì)寄主植物細(xì)胞的生理、生化過(guò)程及細(xì)胞代謝等產(chǎn)生顯著的影響。通過(guò)這些致病效應(yīng)因子的作用病原菌可以克服寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)，從而促進(jìn)和完成對(duì)寄主植物的侵染[5]。效應(yīng)分子由于要分泌到細(xì)胞外起作用，因此一般具有以下特征：（1）含有N端信號(hào)肽;（2）無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域;（3）無(wú)糖基磷脂酰肌醇錨定位點(diǎn);（4）沒(méi)有將蛋白輸送至線粒體或其他胞內(nèi)細(xì)胞器的預(yù)測(cè)定位信號(hào);（5）氨基酸殘基數(shù)量大約為50～300個(gè)氨基酸;（6）富含半胱氨酸而且特異性高于其他病原菌的效應(yīng)分子[6-7]。因此，可以根據(jù)效應(yīng)因子的一般結(jié)構(gòu)特征對(duì)已完成測(cè)序的病原微生物進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其中可能的候選效應(yīng)因子，目前已有多篇報(bào)道針對(duì)多種病原微生物的侯選效應(yīng)因子進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析的報(bào)道[8-10]。轉(zhuǎn)座子是一類能夠在基因組中通過(guò)轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄，在內(nèi)切酶的作用下，在其他基因座上出現(xiàn)的DNA序列。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)子的分析，有助于了解微生物的進(jìn)化歷程[11-12]。本研究于2017年8月對(duì)已有的禾谷鐮刀菌測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)歸納，分析其基因組中的候選效應(yīng)因子序列及轉(zhuǎn)座子序列，以期對(duì)了解禾谷鐮刀菌的致病機(jī)制及進(jìn)化歷程有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 禾谷鐮刀菌全基因組數(shù)據(jù)

禾谷鐮刀菌全基因組數(shù)據(jù)來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.broad-institute），該數(shù)據(jù)庫(kù)還收錄了該病菌預(yù)測(cè)的14 038條預(yù)測(cè)基因DNA序列及其預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

1.2 信號(hào)肽預(yù)測(cè)

SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）是預(yù)測(cè)信號(hào)肽的服務(wù)器。它的功能是預(yù)測(cè)給定的氨基酸序列中是否存在潛在的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)及其所在置，原核生物和真核生物都可以進(jìn)行預(yù)測(cè)。以SignalP 4.1分析給定的氨基酸序列C、S、Y的最大值，以及位于N端和被預(yù)測(cè)的剪切位點(diǎn)間S曲線的中間值，以此區(qū)分信號(hào)肽和非信號(hào)肽。而信號(hào)肽剪切位點(diǎn)則位于預(yù)測(cè)的含有信號(hào)肽蛋白的Y曲線的最大值處，本試驗(yàn)中使用默認(rèn)設(shè)置[13]。

1.3 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

TMHMM Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）主要用于預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域[14]。

1.4 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

ProtComp（http：//www.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompan&group=programs& subgroup=proloc）主要是對(duì)動(dòng)物或真菌中蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。它可將蛋白按以下歸屬進(jìn)行劃分：細(xì)胞核、質(zhì)膜、胞外分泌、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過(guò)氧化物酶體、溶酶體、高爾基體等[15]。

1.5 是否有脂質(zhì)錨定修飾預(yù)測(cè)

本研究通過(guò)Big-PI Predictor（http：//mendel.imp.ac.affgpi/fungi-server.html）對(duì)在真菌糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinosi-tol，簡(jiǎn)稱GPI）修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，判斷預(yù)測(cè)蛋白是否有脂質(zhì)錨定修飾。如果存在糖基磷脂酰肌醇脂質(zhì)錨定修飾，真核生物中蛋白質(zhì)須要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[16]。

1.6 確定預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位

用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）進(jìn)一步確定預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位。可將蛋白的定位歸屬于線粒體、葉綠體、胞外分泌以及其他亞細(xì)胞定位。位置分配是基于相應(yīng)的N末端的前序列預(yù)測(cè)存在，如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、線粒體靶向肽、分泌途徑的信號(hào)肽[17]。

1.7 計(jì)算半胱氨酸含量

通過(guò)CalMolWtCalMolWt（http：//www.cnhupo.cn/CalMW/MYMW.asp）對(duì)蛋白質(zhì)分子量、氨基酸組成進(jìn)行計(jì)算，用于分析篩選出序列的半胱氨酸含量[9]。

1.8 序列比對(duì)

Blastp（http：//blas.ncbi.nlm.nih.gov/Blasucgi？PROGRAM=blastp&PAGETYPE=BlastSearch&LINKLOC=blasthome）是使用蛋白序列在其蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查詢的一種工具。每條所查序列能與數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的每條已知序列進(jìn)行序列比對(duì)，可以通過(guò)所得結(jié)果結(jié)合參數(shù)得到與此相關(guān)的信息。

1.9 轉(zhuǎn)座子的篩選分析

本研究是通過(guò)LTR-FINDER程序（http：//tlife.fudan.edu.cn/ltr_finder/）對(duì)禾谷鐮刀菌全基因組序列進(jìn)行轉(zhuǎn)座子的篩選分析[18]。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，數(shù)據(jù)庫(kù)公布的禾谷鐮刀菌全基因組共有36.45 Mbp，分為433個(gè)重疊群，預(yù)測(cè)基因數(shù)量共計(jì) 14 038個(gè)。

通過(guò)SignalP 4.1 Server對(duì)14 038個(gè)蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)得到1 271個(gè)編碼含N端信號(hào)肽的蛋白，占全基因組蛋白序列的9.05%。對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，序列長(zhǎng)度主要集中在100～600 aa之間，占全部的83.08%，其中長(zhǎng)度在200～300 aa之間的序列最多，占全部的19.27%。序列長(zhǎng)度在900～1 000 aa的最少，僅僅只有總數(shù)的0.78%（圖1）。

在含有信號(hào)肽的分泌型蛋白質(zhì)序列中，如果含有跨膜區(qū)則表明該蛋白可能為膜受體，也可能是膜上的錨定蛋白或離子通道蛋白。本研究使用TMHMM Server v2.0來(lái)預(yù)測(cè)蛋白序列的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，排除具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。從蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果可以看到，在含信號(hào)肽的1 271個(gè)蛋白序列中，有92個(gè)蛋白序列含有2個(gè)或多個(gè)跨膜域，157個(gè)蛋白序列只含有1個(gè)跨膜域，而有1 022個(gè)蛋白序列則不含跨膜域。只含1個(gè)跨膜域的蛋白序列，其所具有的跨膜結(jié)構(gòu)域位置均位于N端，該區(qū)域可能為前期所預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列。由于服務(wù)器并不能完全對(duì)信號(hào)肽序列和所屬跨膜域序列進(jìn)行區(qū)分，因此，本研究選擇不含跨膜域和只含有1個(gè)跨膜域的1 179個(gè)蛋白序列進(jìn)行下一步研究。

將上述初步篩選出的1 179個(gè)蛋白序列進(jìn)一步用ProtComp v9.0進(jìn)行分析，如表2所示，共預(yù)測(cè)到733個(gè)信號(hào)肽分泌至胞外，4個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡膜，4個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡，5個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，16個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體膜，7個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，10個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，31個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，11個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，18個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體膜，11個(gè)傳輸至過(guò)氧化物酶體，29個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，123個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體膜，49個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，128個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)膜。繼而進(jìn)行GPI錨定蛋白的預(yù)測(cè)，以判斷這些被初步推斷為分泌蛋白的是否為胞外蛋白。將733個(gè)分泌蛋白用Big-PI Predictor程序進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有63個(gè)為GPI錨定蛋白，而670個(gè)為非GPI錨定蛋白。

由于效應(yīng)分子的氨基酸殘基數(shù)量一般在50～300 aa之間，因此將這733個(gè)序列按照其長(zhǎng)度進(jìn)行排列，明確了其中有349個(gè)蛋白的氨基酸殘基數(shù)量在 50～300 aa之間。此外，根據(jù)效應(yīng)分子富含半胱氨酸的特點(diǎn)，利用CalMolWt計(jì)算所有候選序列的半胱氨酸含量。將不含半胱氨酸的序列排除之后，得到336個(gè)含有半胱氨酸殘基數(shù)量在1～24個(gè)之間的蛋白序列。最后，將上述符合條件的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用Blastp工具與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出那些與數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有同源性的序列，要求其E-value值小于 1×10-5，最終得到126個(gè)符合上述所有6個(gè)條件的候選效應(yīng)分子。其中有16個(gè)蛋白序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有任何與之同源的序列，剩余的110個(gè)蛋白序列除了與禾谷鐮孢屬的序列有同源性外，與其他物種都沒(méi)有同源性。

現(xiàn)已明確大多數(shù)物種的信號(hào)肽主要是通過(guò)4種類型的信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)被信號(hào)肽酶所識(shí)別并被切割，從而使成熟蛋白穿過(guò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞不同的部位。本研究通過(guò)對(duì)126個(gè)候選效應(yīng)分子所含的信號(hào)肽氨基酸長(zhǎng)度進(jìn)行分析，如圖2所示，含有信號(hào)肽長(zhǎng)度為16～20 aa的蛋白質(zhì)序列數(shù)量最多，所占比例為79.36%，其中尤以所含信號(hào)肽長(zhǎng)度為18 aa的蛋白序列居多，所占比例為24.60%。

利用LipoP 1.0 Server對(duì)上述分泌蛋白進(jìn)行信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示114個(gè)蛋白序列含有SpI型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，7個(gè)含有CYT型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，5個(gè)含有SpII型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，所占比例分別為90.48%、5.56%、3.97%，說(shuō)明禾谷鐮刀菌中的候選效應(yīng)分子大部分是由SpI型信號(hào)肽酶進(jìn)行識(shí)別。

此外還對(duì)20種氨基酸在126個(gè)候選效應(yīng)分子信號(hào)肽中出現(xiàn)的頻率進(jìn)行了分析。如圖3所示，在組成信號(hào)肽的氨基酸中，丙氨酸的數(shù)量最多，為3 422個(gè)，占10.15%;其次為甘氨酸，有3 275個(gè)，占9.73%;其后依次為絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、精酰胺、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、組氨酸、半胱氨酸、色氨酸，分別占8.41%、8.15%、6.02%、5.46%、5.29%、4.98%、4.98%、4.81%、4.38%、4.19%、4.16%、4.07%、3.11%、2.92%、2.67%、2.52%、2.49%、1.43%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，非極性、疏水氨基酸（丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、脯氨酸）的出現(xiàn)頻率最高，占41.63%;其次為極性、不帶電荷的氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺），占29.62%;帶正電荷的堿性氨基酸（賴氨酸、精酰胺、組氨酸）占10.87%;帶負(fù)電荷的酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）占9.19%;芳香族氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸）占8.61%。

另外，對(duì)禾谷鐮刀菌的433個(gè)重疊群的基因組序列利用LTR-FINDER程序進(jìn)行了轉(zhuǎn)座子序列篩選，結(jié)果并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的存在。

3 結(jié)論與討論

禾谷鐮刀菌全基因組測(cè)序的完成和公布，為研究禾谷鐮刀菌的分泌蛋白、效應(yīng)分子、致病因子及與植物之間互作提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)對(duì)禾谷鐮刀菌的基因組序列的分析與篩選，對(duì)14 038個(gè)蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)得到1 271個(gè)編碼含N端信號(hào)肽的蛋白。其中不含跨膜域和只含有1個(gè)跨膜域的有1 179個(gè)蛋白，進(jìn)一步分析預(yù)測(cè)，其中733個(gè)蛋白分泌至胞外，這些蛋白有可能是與禾谷鐮刀菌致病相關(guān)的候選效應(yīng)分子。繼而進(jìn)行GPI錨定蛋白的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有63個(gè)為GPI錨定蛋白，而670個(gè)為非GPI錨定蛋白。真菌細(xì)胞壁上的GPI錨定蛋白對(duì)真菌的黏附、形態(tài)轉(zhuǎn)換和細(xì)胞壁合成有著重要的影響。微生物的黏附是其致病性最重要的決定因素之一[19-20]，真菌病原體被確定的黏附素很少，因此預(yù)測(cè)670個(gè)非GPI錨定蛋白為候選效應(yīng)因子。

利用CalMolWt計(jì)算所有候選序列的半胱氨酸含量，將不含半胱氨酸的序列排除之后，得到336個(gè)含有半胱氨酸殘基數(shù)量在1～24個(gè)之間的蛋白序列。最后， 將上述符合條件的

氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用Blastp工具與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出那些與數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有同源性的序列，最終得到126個(gè)符合條件的候選效應(yīng)分子。其中有16個(gè)蛋白序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有任何與之同源的序列，剩余的110個(gè)除了與禾谷鐮孢屬的序列有同源性外，與其他物種都沒(méi)有同源性。將分泌蛋白進(jìn)行信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示114個(gè)蛋白序列含有SpI型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，7個(gè)含有CYT型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，5個(gè)含有SpII型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)。說(shuō)明禾谷鐮刀菌中的效應(yīng)分子大部分是由SpI型信號(hào)肽酶進(jìn)行識(shí)別的。

此外，還對(duì)20種氨基酸在126個(gè)候選效應(yīng)分子信號(hào)肽中出現(xiàn)的頻率進(jìn)行了分析，得出丙氨酸的數(shù)量最多，含量最低的是色氨酸。最后測(cè)得126個(gè)符合要求的禾谷鐮刀菌候選效應(yīng)分子大多屬于小型蛋白，其信號(hào)肽集中在16～20個(gè)氨基酸且含有大部分的SpI型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)。這些效應(yīng)分子可能是禾谷鐮刀菌的致病因子。

本研究還對(duì)禾谷鐮刀菌的433個(gè)公布的重疊群序列利用LTR-FINDER程序進(jìn)行轉(zhuǎn)座子查找分析，結(jié)果并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的存在，該結(jié)果值得進(jìn)一步研究分析。

通過(guò)一系列的篩選與分析，可以更好地從分子水平系統(tǒng)地了解禾谷鐮刀菌基因與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與組成。并對(duì)進(jìn)一步研究禾谷鐮刀菌與寄主植物之間的關(guān)系有一個(gè)更好的基礎(chǔ)，為今后研究其致病性以及其病源危害奠定基礎(chǔ)。

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