兩種檢測豬瘟和豬偽狂犬病毒抗體方法比較

謝玉潔 占松鶴 何長生 章健 張賀森 李郁

（1，安徽農業大學動物科技學院 230036； 2，安徽省動物疫病預防與控制中心 230091； 3，安徽省阜陽市動物衛生監督所236400； 4，成都微瑞生物科技有限公司 611731）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，以發病急、高熱稽留和細小血管壁變性引起廣泛出血、梗塞和壞死等變化為特征[1]。豬偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜和野生動物共患的一種急性、熱性傳染病，主要以仔豬致命性腦炎、育肥豬呼吸道癥狀及母豬流產為特征[2]。CSF 和PR 是目前危害中國養豬業發展的主要疫病之一。世界動物衛生組織（OIE）將CSF 和PR 列為必須通報的動物疫病，我國農業農村部則將CSF 和PR 分別列為一類和二類動物疫病，同時CSF 和PR 也是我國《國家中長期動物疫病防治規劃（2012-2020年）》 中優先防治的動物疫病，并要求至2020年全國所有種豬場達到凈化標準。

疫苗接種是預防和控制CSF 和PR 的重要手段，而檢測血清抗體不僅可為CSF 和PR 免疫提供依據，也可進行PRV 野毒感染的鑒別。OIE 推薦的CSFV 和PRV 抗體檢測方法是酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和抗體中和試驗（ANT），但ANT 對實驗條件和操作人員的要求很高，且耗時長，僅適合專業實驗室進行少量樣本檢測，不宜推廣應用。由于ELISA 具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優點，因此，該方法是當前國際上承認的唯一適合大規模應用的CSFV 和PRV 抗體檢測方法。

目前商品化的CSFV 和PRV 抗體ELISA 檢測試劑盒有阻斷ELISA 和間接ELISA 兩種。在評價ELISA 檢測方法時，最重要的兩個指標是敏感性和特異性。阻斷ELISA 使用了單克隆抗體，因此，檢測的特異性更高； 而間接ELISA 更側重于敏感性。兩種ELISA 法在實際應用過程中均具有合理性，但需要比較完備實驗儀器（如全波長酶標儀等）和經驗豐富的技術人員，且一次檢測至少需要4h，對于基層獸醫機構、養豬場來說適用性不強。Wellray CSFV 和PRV 抗體快速檢測方法系應用鑭系元素作熒光標記物建立的一種既具有金標層析技術簡單、方便、快捷，又具有ELISA 準確、特異、敏感的CSFV 和PRV 抗體鑭系熒光免疫層析法（LFICA）[3]。為進一步評價LFICA 在檢測臨床樣品中的適用性，本試驗將Wellray CSFV 和PRV 抗體快速檢測方法與美國愛德士（IDEXX）公司生產的ELISA 抗體檢測方法進行比較，以期為臨床檢測提供性價比高、使用方便、特異性強、靈敏度高的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 檢測試劑盒

Wellray CSFV 抗體快速檢測試劑盒（以下簡稱CSFV-Ab-LFICA），Wellray PRV-gB、PRV-gE 抗體快速檢測試劑盒（以下分別簡稱PRV-gB-Ab-LFICA、PRV-gE-Ab-LFICA）均為成都微瑞生物科技有限公司產品。美國愛德士（IDEXX）公司生產的ELISA （阻斷法）CSFV 抗體檢測試劑盒（以下簡稱CSFV-Ab-ELISA），ELISA （間接法）PRV-gB、PRV-gE 抗體檢測試劑盒 （以下分別簡稱PRV-gB-Ab-ELISA、PRV-gE-Ab-ELISA）。

1.2 檢測樣品

被檢血清共計177 份，其中用于檢測CSFV-Ab 的血清57份，檢測PRV-gB-Ab 的血清63 份，檢測PRV-gE-Ab 的血清57 份。

1.3 檢測方法

1.3.1 Wellray CSFV-Ab-LFICA、PRV-gB-Ab-LFICA 和PRV-gE-Ab-LFICA

按照試劑盒使用說明進行。依據檢測需求信息選擇相應批次的標準曲線、高敏熒光分析儀檢測的檢測線（T）和質控線（C）的熒光信號，進行T/C 熒光比值云平臺自動計算。結果判定：T/C 值＞0.1 為陽性，T/C 值＜0.1 為陰性。

1.3.2 IDEXX CSFV-Ab-ELISA

按照試劑盒使用說明進行。當陰性平均值＞0.500，陽性對照阻斷率＞50%時，檢測結果有效。阻斷率/%=100× [陰性對照A （450）值-樣本A （450）值]/陰性對照A （450）值。結果判定：樣品的阻斷率≥40%為陽性，30%＜阻斷率＜40%為可疑，阻斷率≤30%為陰性。

1.3.3 IDEXX PRV-gB-Ab-ELISA 和IDEXX PRV-gE-Ab-ELISA

分別按照試劑盒使用說明進行。當陰性平均值減去陽性平均值≥0.300 時檢測結果有效。S/N=樣品A （650）值/陰性平均值。結果判定：樣品的S/N≤0.6 為陽性，0.6＜S/N≤0.7 為可疑，S/N＞0.7 為陰性。

1.3.4 符合率比較

用Wellray 和IDEXX 的兩種檢測方法對177 份血清進行檢測，檢測試劑盒均在有效期內，操作和結果判定均按試劑盒說明書進行。參考吳泰相等 [4]的方法（表1），計算符合率、相對敏感性和相對特異性。符合率= (a+d) /(a+b+c+d)； 相對敏感性=a/(a+c)； 相對特異性=d/(b+d)； Kappa 值計算公式：Kappa=2(ad-bc) /(p1q2+p2q1)。Kappa 值＞0.8，表明一致性極高； 0.60＜Kappa 值≤0.80； 表明高度一致； 0.40＜Kappa 值≤0.60； 表明中度一致； Kappa 值≤0.40，表明一致性差。

表1 Wellray 和IDEXX 兩種檢測方法一致性判定方法

2 結果與分析

2.1 CSFV-Ab檢測

采用Wellray CSFV-Ab-LFICA 和IDEXX CSFV-Ab-ELISA兩種檢測方法對57 份血清進行CSFV-Ab 檢測。結果顯示，Wellray CSFV-Ab-LFICA 檢出陽性30 份、陰性27 份； IDEXX CSFV-Ab-ELISA 檢出陽性25 份、陰性32 份； 符合率87.72%，相對敏感性96%，相對特異性81.25%，Kappa 值為0.756，表明兩者高度一致，見表2。

表2 Wellray CSFV-Ab-LFICA 和IDEXX CSFVAb-ELISA 檢測CSFV-Ab 結果比較

2.2 PRV-gB-Ab 檢測

采用Wellray PRV-gB-Ab-LFICA 和IDEXX PRV-gB-Ab-ELISA 兩種檢測方法對63 份血清進行PRV-gB-Ab 檢測。結果顯示，Wellray PRV-gB-Ab-LFICA 檢出陽性35 份、陰性28份； IDEXX PRV-gB-Ab-ELISA 檢出陽性36 份、陰性27 份；符合率92.06%，相對敏感性91.67%，相對特異性92.59%，Kappa 值為0.839，表明兩者一致性極高，見表3。

表3 Wellray PRV-gB-Ab-LFICA 與IDEXX PRV-gBAb-ELISA 檢測PRV-gB-Ab 結果比較

2.3 PRV-gE-Ab 檢測

采用WellrayPRV-gE-Ab-LFICA 和IDEXX PRV-gE-Ab-ELISA 兩種檢測方法對57 份血清進行PRV-gE-Ab 檢測。結果顯示，WellrayPRV-gE-Ab-LFICA 檢出陽性24 份、陰性33 份；IDEXX PRV-gE-Ab-ELISA 檢出陽性21 份、陰性36 份； 符合率84.21%，相對敏感性85.71%，相對特異性83.33%，Kappa值為0.671，表明兩者高度一致，見表4。

表4 Wellray PRV-gE-Ab-LFICA 與IDEXX PRV-gEAb-ELISA 檢測PRV-gE-Ab 結果比較

3 討論與結論

通常反映試驗判定結果與標準診斷結果一致性的2 個指標是符合率和Kappa 值，而反映試驗結果的真實性是特異性和敏感性[5-6]。本試驗系采用了兩種檢測CSFV 和PRV 抗體檢測方法進行比較，結果顯示，Wellray CSFV 抗體和PRV （gB、gE）抗體LFICA 快速檢測方法與國際通用的美國愛德士（IDEXX）公司生產的ELISA 抗體檢測方法的符合率分別為87.72%、92.06%、84.21%，相對特異性分別為81.25%、92.59%、83.33%，相對敏感性分別為96%、91.67%、85.71%； Kappa 值分別為0.756、0.839、0.671。結果表明，Wellray CSFV 和PRV抗體LFICA 快速檢測方法與美國愛德士（IDEXX）公司生產的ELISA 抗體檢測方法相比，檢測結果具有較高的可重復性、真實性和穩定性，可用于臨床樣品的檢測。

CSF 和PR 是我國優先防治和凈化的病種，檢測方法和檢測試劑的選擇尤為重要。本試驗中的Wellray CSFV 和PRV 抗體LFICA 快速檢測方法以雙抗原夾心法為基礎，采用微瑞高敏熒光層析技術快速測定樣本中的抗體含量，通過WellRayAPP/PC 軟件操作WellRay高敏熒光儀在15min 內即可完成檢測。與進口試劑盒（如IDEXX 的ELISA 抗體檢測試劑盒）相比成本低廉，操作簡便，時間較短，無須昂貴復雜的儀器設備，更適合于基層獸醫機構、養豬場的使用，在大規模樣品檢測中也更有優勢。