基于SSR標記的MCID法鑒定中國自主選育的葡萄品種

魏新科，樊秀彩，王晨，劉崇懷*

（1. 南京農業大學園藝學院/江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095；2. 中國農業科學院鄭州果樹所，河南鄭州 450009）

葡萄屬于葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis），是多年生落葉木質藤本植物[1]，按用途可分為鮮食品種、釀酒品種以及砧木品種等。由于其具有極高的經濟價值和社會效益，在世界范圍內有大面積栽培，是占據重要地位的果樹之一。葡萄栽培歷史悠久，種類豐富，近年來，隨著科學技術的發展，葡萄育種進程加快，品種間基因交流更加頻繁，種類日益繁多。許多葡萄品種在植物學性狀上非常相似，傳統的形態學品種鑒定方式難以達到理想的鑒別效果。生化標記容易受環境、氣候影響，可靠性低[2]。SSR分子標記能夠直接顯示出DNA分子水平上的差異，不受環境等因素的影響，具有多態性高、共顯性、操作簡便快捷、結果穩定等優點，被廣泛應用于生物群體遺傳結構分析、基因鑒定、生物多態性分析等方面[3-4]。

人們通常利用分子標記結果繪制DNA指紋圖譜，或者通過軟件生成種質指紋圖譜后進行聚類分析，繪制聚類樹狀圖表示種質之間的遺傳關系，判斷其遺傳距離，但針對品種鑒定方面提供的信息不夠直觀。為了將DNA指紋轉化成區分不同種質的有效信息，張曉瑩等[5]提出了基于DNA標記的人工繪制植物品種鑒別圖（Manual Cultivar Identification Diagrm，MCID）方法應用于品種鑒定，最先應用在葡萄品種鑒定上。MCID法是在利用引物進行PCR擴增后，分析同一對引物擴增出的不同品種的電泳條帶，條帶相同的分為一組，區分條帶特殊的品種，標記各引物及條帶從而得到不同引物擴增出的不同品種的條帶鑒定圖。

MCID法可以將DNA標記得到的遺傳信息轉換為更加直觀，便于參考的鑒定圖。本研究利用9對SSR引物進行PCR擴增，根據同一種引物下不同葡萄品種DNA序列長度的多態性采用MCID方法對中國自主選育的308個葡萄品種進行鑒定。同時對這些品種進行了遺傳多樣性分析，以期為我國葡萄品種鑒定、品種保護提供理論依據和參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料主要來自中國農業科學院鄭州果樹研究所國家葡萄種質資源圃和張家港市神園葡萄科技有限公司，共308份葡萄種質材料（表1）。于2019年4月取植株頂端的幼嫩葉片，暫存于冰盒中帶回實驗室，之后液氮凍樣保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 DNA提取和檢測

表1 308份供試葡萄種質資源Table 1 308 grape germplasms resource in this research

續表1 Continued table 1

使用北京諾貝萊生物科技有限公司生產的提取植物基因組DNA試劑盒，參考說明書提取308個葡萄品種的DNA。利用1%的瓊脂糖凝膠對已提取的DNA進行檢測。將含有DNA條帶的瓊脂糖凝膠放在自動成像系統中的紫外光照下觀察并拍照。利用Nano Drop1000超微量分光光度計檢測DNA樣品的濃度、OD260/OD280等參數，將質量較好的DNA樣品稀釋至50 ng/μL，放入-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 引物選擇及PCR擴增

研究參照國際葡萄品種目錄數據庫（Vitis Internationl Variety Catalogue, VIVC, http://www.vivc.de/）公布的9對葡萄國際通用引物進行篩選分析，引物序列由通用生物公司合成。各引物序列如下：

采用如下比例的25 μL PCR反應體系：12.5 μL的Master Mix，1 μL的DNA模板和9.5 μL的雙蒸水，上下游引物各1 μL。PCR反應程序為：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，50～60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；最后72 ℃延伸2 min，結束后4 ℃保存。

表2 引物序列信息Table 2 Information of primer sequences

1.4 PCR產物電泳檢測

SSR-PCR產物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測，電泳結束后取出膠片用去離子水清洗，之后用0.1%硝酸銀溶液震蕩染色5 min，然后用去離子水漂洗1次，加入1.5% NaOH 500 mL+0.4% 甲醛溶液進行顯色反應，顯色時長視情況而定，至條帶顯示清晰即可，顯色后用去離子水漂洗一次，取出膠片拍照。

1.5 數據統計與分析

采用0，1統計法對PCR產物擴增結果進行統計，區分不同引物擴增出的各品種特異條帶。在電泳圖上選取一個條帶長度，將在同一分子量上，有特征條帶的記為1，沒有條帶的記為0，構建0/1矩陣。根據9對引物對308個葡萄品種的擴增結果所構建的0/1矩陣，利用NTSYSpc Version 2.10e軟件計算兩兩品種間的遺傳相似系數，并根據遺傳相似系數，利用MEGA 7軟件，采用UPGMA法對308份葡萄品種資源進行聚類分析，后期使用FigTree 1.3對聚類圖進行修飾。

1.6 人工繪制植物品種鑒定圖

得到聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果后，首先選擇任意一對引物的電泳圖，在電泳圖上選取幾個清晰的條帶位置，統計各片段長度處的條帶多態性，將在該處有條帶的品種歸為一類，無條帶的品種歸為另一類。在每一大類中的品種可以繼續通過其他引物進行區分，每一大類都可以繼續分為幾小組，直到所有品種被鑒別區分出來。之后，根據分組的情況，人工繪制植物品種鑒別圖，將每一步用到的引物及多態性譜帶大小標注到樹形鑒別圖的相應位置上[6-8]。人工繪制的植物品種鑒別圖是基于PCR擴增后的譜帶形態統計出的結果，以引物作為節點，以特征譜帶的有無作為分類的依據，在每個節點后是該引物對不同品種的區分結果，包括區分出的類別或者是直接區分出來的單個品種[9]。

2 結果與分析

2.1 DNA的提取結果

本研究利用植物基因組DNA試劑盒提取葡萄DNA，部分葡萄品種的DNA電泳結果如圖1，DNA片段較為完整，沒有發生明顯的降解，條帶較為清晰，根據Nano Drop1000超微量分光光度計檢測結果顯示，DNA濃度在48～200 ng/μL，OD260/OD280值在1.85～2.1，大部分品種在1.9～2.0，總體上DNA質量較好，純度滿足要求，可以用于后續的擴增、鑒定等工作。

2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳結果

聚丙烯酰胺凝膠電泳與瓊脂糖凝膠電泳相比，可以區分相差個位數堿基的片段，試驗結果更加精確。圖2為其中3對引物VVS2、VVMD5、VVMD27對部分品種的擴增條帶結果，大部分條帶清晰可見，靠近兩側的條帶容易出現傾斜，原因可能是灌膠時沒有保持水平或者等待膠凝固時兩側的板子夾得不嚴。

圖1 52個葡萄品種基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Genomic DNA agarose gel electrophoresis map of 52 grape varieties

圖2 引物VVS2(C)、VVMD5(D)、VVMD27(F)對部分品種擴增結果Figure 2 Primer VVS2(C), primer VVMD5(D), primer VVMD27(F) amplification results for some varieties

2.3 308個葡萄品種遺傳多樣性分析

根據9對引物對308個葡萄品種的擴增結果所構建的0/1矩陣，利用NTSYSpc Version 2.10e軟件計算兩兩品種間的遺傳相似系數，并根據遺傳相似系數，利用MEGA 7軟件，采用UPGMA法對308份葡萄品種資源進行聚類分析，后期使用FigTree 1.3對聚類圖（圖3）進行修飾。

聚類結果表明：308個葡萄品種共分為9類，其中有4個大類（A、B、E、F）和5個小類（C、D、G、H、I）。

A類包含47個葡萄品種，幾乎全部是鮮食品種，占該組材料的95.7%。A類又可分為兩個部分。第一部分含有16個品種，其中主要是江蘇省張家港市神園葡萄科技有限公司培育的，如‘園金香’‘園香妃’‘園紅指’‘園綠指’‘園野香’等13個鮮食葡萄品種。第二部分31個品種主要為歐亞種，包括：‘墨玉’‘木納格’‘庫斯卡奇’3個新疆地方品種，以及‘鄭美’和‘金田美指’，這兩個品種的親本之一均為‘美人指’?！浯涿倒濉F妃玫瑰’和‘京紫晶’因都含有‘葡萄園皇后’血緣，因此也被聚合到了一起。

B類中包括40個品種，全部為鮮食品種。其中，巨峰系品種大多聚在這一類，共占17.5%。例如：‘貴園’‘峰光’‘戶太8號’‘夕陽紅’‘香悅’等。此外，由鄭州果樹研究所選育的‘鄭葡1號’‘鄭葡2號’因親本相同聚在了一起；從‘紫珍香’自交后代中選出的優良品種‘沈農碩豐’和其親本直接聚在了一起。

E類共有51個品種。其中包含3個野生種：‘桑葉葡萄’‘華東葡萄’‘山葡萄’，這3個種直接聚類在了一起；含有‘玫瑰香’血緣的9個品種‘京秀’‘早熟玫瑰香’‘大粒玫瑰香’‘艷紅’‘瑪瑙’‘澤玉’‘愛神玫瑰’‘澤香’‘紅香蕉’聚類在這一組，占該組材料的17.6%。山西果樹研究所以‘瑰寶’為母本育成的‘晚黑寶’和‘秋紅寶’聚在了一起。

F類包含49個品種，其中包括22個中國地方品種，占該類材料的44.9%。材料中43.1%的地方品種聚集在本類中?！績骸P口葡萄’‘早亞寶’‘白葡萄’‘無籽露’‘白老虎眼’‘馬熱子’7個新疆地方品種聚集在一起。該類中還包括我國的7個釀酒品種，如‘北醇’‘北玫’‘熊岳白’‘黑圓珠’等。

C、D、G、H、I五個小類，各包含21、25、25、24、26個品種。C類中‘沈530’‘沈529’‘沈551’三個砧木品種直接聚集在一起；同為歐美種的‘黑香蕉’和‘紅雙味’因親本之一都為‘葡萄園皇后’所以聚在一起。D類中含有1份蘡薁葡萄，即‘多裂葉蘡薁’；‘那布古珠’‘黑破黃’‘木拉格’同為地方品種聚在一起；‘伊犁香葡萄’和‘白沙玉’同為新疆地方品種聚在一起。G類含有兩份刺葡萄，即‘紫秋’和‘刺葡萄940’；‘鄭果25號’和‘公釀1號’同為釀酒品種，聚集在一起。該試驗中大部分無核品種，如‘鞏義無核白’‘無核翠寶’‘岳紅無核’‘緊穗無籽’‘皇家無核’都聚在H類中。I類中包含9個地方品種，如‘伊犁葡萄’‘微紅白’‘阿克塔那衣’‘馬奶’‘賽勒可阿依’‘白油亮’等，占該類的34%；‘早霞玫瑰’與‘金田0608’都以‘秋黑’做親本，聚在了一起。

通過對308份我國自主選育的葡萄品種進行聚類分析可以看出，歐亞種葡萄與歐美種葡萄沒有明顯區分開來，說明兩者親緣關系較近。聚類結果表明同一育種單位培育且遺傳關系較近的品種大多會聚集在一起。例如，由鄭州果樹研究所選育的‘鄭葡1號’‘鄭葡2號’因親本相同聚在了一起；由山西果樹研究所以‘瑰寶’為母本育成的‘晚黑寶’和‘秋紅寶’聚在了一起。不同用途的葡萄品種，大多也會分類，例如B類全部是鮮食品種，砧木品種大多聚集在C類，釀酒品種多大聚集在F類。由于所選材料品種較多，遺傳背景較為復雜，部分同一種屬類型的品種未能劃分為同一亞類當中，這需要進一步研究探討。

近年來，隨著我國葡萄育種進程的加快，國內品種間以及與國際品種基因交流頻繁，導致了葡萄遺傳背景變得狹窄，因此拓展育種基礎以及尋找更多的野生資源勢在必行。本研究應用SSR標記從分子水平上反映了我國自主選育的葡萄種質資源的親緣關系，為我國葡萄育種研究提供了一定的參考依據。

圖3 基于SSR標記的308份葡萄種質聚類分析圖Figure 3 Dendrogram of 308 grape cultivars based on SSR markers

2.4 308個葡萄品種鑒定分析

應用基于SSR分子標記的人工繪制植物品種鑒別圖法（MCID）對中國自主選育的308個葡萄品種進行鑒定。結合9對國際通用引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖將308個中國自育葡萄品種鑒別區分開來。為了使圖像更加清晰明了，用對應的數字編號代替葡萄品種名稱。

圖4 308個中國自主選育的葡萄品種CID圖Figure 4 CID of 308 grape varieties independently selected in China

首先依據引物VrZAG79的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖上長度為275 bp、260 bp、250 bp的3條條帶將308個葡萄品種分為8大組，有特征條帶用(+)表示，無特征性條帶用(-)表示。第一組是275 bp(-)、260 bp(-)和250 bp(-)，共包括30個品種；第二組是275 bp(+)、260 bp(-)和250 bp(-)，共包括8個品種，數目最少；第三組是275 bp(-)、260 bp(+)和250 bp(-)，包括33個品種；第四組是275 bp(+)、260 bp(-)和250 bp(+)，包括19個品種；第五組是275 bp(-)、260 bp(-)和250 bp(+)，共包括50個品種；第六組是275 bp(-)、260 bp(+)和250 bp(+)，包括57個品種；第七組是275 bp(+)、260 bp(+)和250 bp(-)，共包括72個品種，品種數目最多；第八組是275 bp(+)、260 bp(+)和250 bp(+)，共包括39個品種。

通過引物VrZAG79將308個品種分為8組之后，繼續利用更多的引物分別鑒定8個組的所有品種。以第8組的39個品種為例，首先利用引物VVMD27的特征條帶210 bp、195 bp、185 bp可以將39個品種分為7個小組，帶型為210 bp(-)、195 bp(-)、185 bp(-)的為8-1組，包括編號為47、134、246、247、256、281在內的共6個品種；帶型為210 bp(-)、195 bp(+)、185 bp(-)的為8-2組，包括編號為2、26、27、41、63、64、268在內的7個品種；帶型為210 bp(-)、195 bp(-)、185 bp(+)的為8-3組，只包含223號品種‘達拉依’，所以該品種被鑒別出來；帶型為210 bp(+)、195 bp(+)、185 bp(-)的為8-4組，包括編號為54、196、300在內的3個品種；帶型為210 bp(-)、195 bp(+)、185 bp(+)的為8-5組，包括編號為17、104、113、137在內的4個品種；帶型為210 bp(+)、195 bp(-)、185 bp(+)的為8-6組，包括編號為132、147在內的2個品種；帶型為210 bp(+)、195 bp(+)、185 bp(+)的為8-7組，包括其余的16個品種。在利用引物VVMD25擴增的大小為275 bp、265 bp、255 bp的條帶對8-1、8-2、8-4、8-5、8-6、8-7進行進一步鑒定。8-1組中帶型為275 bp(+)、265 bp(-)、255 bp(-)的247號品種‘皇家無核’被鑒別出來；帶型為275 bp(+)、265 bp(-)、255 bp(+)的256號品種‘新郁’被鑒別出來；帶型為275 bp(-)、265 bp(+)、255 bp(-)的134號品種‘謝克蘭格’被鑒別出來；帶型為275 bp(-)、265 bp(+)、255 bp(+)的47號品種‘月光無核’被鑒別出來；246、281號品種被分配到275 bp(+)、265 bp(+)、255 bp(-)帶型中，未能鑒別出來，記為8-1-1組。之后利用第四對引物VrZAG62擴增的長度為195 bp、185 bp、175 bp的條帶對8-1-1組進行分析，發現246號品種‘沈農金皇后’帶型為195 bp(+)、185 bp(+)、175 bp(-)，281號品種‘黑指’帶型為195 bp(+)、185 bp(+)、175 bp(-)，成功鑒別出來。

其他7大組按照此方法依次鑒定，最多利用8對引物就可以區分所有品種。最后，根據所有引物及相應譜帶信息繪制我國自主選育的308個葡萄品種的MCID鑒定圖（圖4）。MCID圖如同化學元素周期表用于元素信息查閱一樣直觀清晰，簡單明了，所獲得的葡萄CID圖譜可以提供鑒別這些品種所需要的引物以及依據的多態性譜帶，具有高度的可行性與實用性。具體使用方法如下：①通過CID圖譜確定待檢測品種所需要的引物以及多態性條帶；②利用篩選的引物進行PCR擴增；③通過分析待檢測品種PCR擴增的多態性條帶將其鑒別出來。例如：區分‘鄭果5號’（132）,‘沈陽玫瑰’（147）和‘達拉依’（223）3個品種時，首先在MCID上可以看到3個品種最先分支的引物為VVMD27，多態性條帶為210 bp、195 bp、185 bp。該引物將3個品種區分為兩組，‘達拉依’帶型為210 bp(-)、195 bp(-)、185 bp(+)直接鑒別出來。‘沈陽玫瑰’和‘鄭果5號’帶型相同，都為210 bp(+)、195 bp(-)、185 bp(+)。之后在利用VVMD5引物和260 bp條帶即可將‘鄭果5號’和‘沈陽玫瑰’區分開，這樣3個品種就全部鑒別出來。

3 討論與結論

中國是世界上葡萄遺傳資源最豐富的起源中心之一，豐富的種質資源為葡萄領域研究提供了眾多機會，同時也蘊藏了很多的挑戰。隨著葡萄在我國的種植面積不斷擴大和下游產業的發展，對葡萄的引種、品種鑒定工作提出了更高更豐富的要求[10]。傳統的品種鑒定方式限制因素太多，越來越無法滿足鑒定要求。DNA分子標記技術的發展使這些問題迎刃而解；與第一代DNA分子標記相比，SSR標記具有多態性高、重復性好、操作簡便快捷等優點，在國內外研究中應用廣泛[11]。Lefort等[12]使用SSR分子標記，采用11對SSR引物對50個希臘葡萄品種（包括鮮食和釀酒品種）進行了品種鑒定和遺傳特性的研究。Riaz等[13]于2008年首次使用SSR分子標記技術分析北美‘麝香葡萄’栽培及雜交品種，研究使用14對SSR標記對57個葡萄品種進行鑒定并繪制了指紋圖譜，通過比較親本和子代的共享等位基因，驗證了已發表品種的育種記錄。2015年Mihaljevi?等[14]分析了克羅地亞和黑山（歐洲東南部）的284個地方葡萄品種，共使用9對SSR引物，發現了25個之前未曾報道過的基因型，并將得到的數據與歐洲數據庫以及其他已報道的相關研究結果進行比對，發現了一些新的同名異物和同物異名品種。樊秀彩等[15]篩選出7對能擴增出父本特異條帶的引物，用SSR分子標記結合形態學分析的方法，對山葡萄和河岸葡萄種間雜交后代進行鑒定，結果表明，雜交后代中有161株是真雜種，后代中還產生了新條帶，因此認為SSR標記可有效地對葡萄屬種間雜種進行鑒定，從而創新葡萄種質資源。

同DNA指紋圖譜和聚類分析相比，MCID法可以將DNA標記得到的遺傳信息轉換為更加直觀、更方便參考的鑒定圖，具有很強的操作性和很高的參考價值。在本研究之前，MCID法已經被用于其他園藝植物的鑒定，如基于SSR 標記的MCID法鑒定花梅品種[16]和利用基于RAPD標記的MCID法鑒定枇杷[17]、蘿卜[18]等，這些研究都表明了MCID法在鑒定品種上的可行性。

本研究利用9對SSR引物進行PCR擴增，根據同一種引物下不同葡萄品種DNA序列長度的多態性來人工繪制植物品種鑒別圖（MCID）對中國自主選育的308個葡萄品種進行鑒定。結果表明，最多利用8對引物就可以區分所有品種，同時對這些品種進行了遺傳多樣性分析，以期為我國葡萄品種鑒定、品種保護提供理論依據和參考價值。本研究涉及了我國自主選育的絕大部分葡萄品種，仍有少量品種沒有形成準確可靠的CID圖，將我國自育品種遺傳信息匯總并制作CID圖可以為我國育種者提供更加直觀的信息，對我國育成具有自主知識產權的世界性優良品種有推動作用。此外，許多國外培育的優良葡萄品種均可繪制CID圖，將世界范圍內的優良種質整合到一起，建立起一個以MCID法制成的葡萄品種鑒定信息庫，使分子標記技術更加有效地服務于育種工作，更好地利用現有品種資源開發新品種、新品系，同時還可以應用于種質資源管理和品種保護工作中，對葡萄產業可持續性發展有積極的意義。