208個葡萄品種染色體倍性的流式細胞分析

裴丹，葛孟清，董天宇，魏新科，劉崇懷，房經貴*

（1. 南京農業大學園藝學院，江蘇南京 210095；2. 中國農業科學院鄭州果樹所/農業部果樹育種重點實驗室，河南鄭州 450009）

葡萄（2X=38）是二倍體植物。其在進化與利用過程中，形成了很多不同倍性的葡萄品種，且葡萄無性繁殖的特點能將多倍體的優良性狀穩定地保存下去。由于多倍體葡萄具有生長旺盛、枝粗、葉厚、果大、產量高、同化物質含量高、種子數量少且部分發育不良，果實成熟期提前等優點，在生產上廣泛推廣。

染色體鑒定方法分為直接鑒定法與間接鑒定法。直接鑒定法又稱染色體計數法，可直接鑒定染色體倍性。這種方法鑒定結果準確，但耗時長，對操作要求高，不適宜大量樣品材料的倍性鑒定。間接鑒定法不能直接進行染色體計數，是通過觀察植株形態、細胞形態，進行雜交試驗或微觀分子技術來間接進行染色體倍性鑒定。其中，植物形態學鑒定法較為簡便，但受個人主觀因素影響較大；細胞形態學鑒定法比較可靠，但操作過程復雜；梢端組織鑒定法能夠準確鑒定嵌合體倍性；雜交鑒定倍性所需時間較長，且需事先了解植物遺傳規律[1]。流式細胞術（Flow cytometry，FCM）是應用流式細胞儀進行分析、分選的技術，對處于液流中的各種熒光標記微粒進行多參數快速準確地定性、定量測定。在植物學研究中，FCM主要用于檢測植物細胞核DNA含量[2]及其倍性水平[3]，其中分裂間期G1期的DNA含量可間接反映該細胞的倍性水平，因此測定植物細胞核DNA含量的同時可以獲取倍性水平相關數據，繪制成流式圖譜，峰圖縱坐標為粒子數，橫坐標為相對熒光強度。

葡萄染色體倍性的信息對于葡萄品種資源的科學利用具有參考價值[4]。本文對目前中國自主育成的部分葡萄品種進行倍性鑒定，以期為葡萄倍性鑒定及多倍體育種提供理論依據。同時，鑒別葡萄倍性水平還對研究其系統進化、澄清物種起源模式具有非常重要的意義[5]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

隨機取自中國農科院鄭州果樹所國家葡萄資源圃以及其他院所保存的208個葡萄品種。選取植株幼嫩葉片，經冰袋運輸后置于4 ℃下保存，在最短時間內完成測定。

1.2 實驗方法

1.2.1 緩沖液的配制

解離細胞核所用的解離液按照表1[6]中的配方配制，通過試驗進行篩選。

染色緩沖液為解離液中加入20 mg/L碘化丙啶（PI）和20 mg/L的RNA酶。

表1 解離液種類及組分Table 1 Categories and componets of dissociation solutions

1.2.2 細胞核溶液的制備

（1）稱取約1 g幼嫩的葡萄葉片，蒸餾水洗凈表面塵土，濾紙吸干后放入預冷的培養皿內，加入預冷的解離液（1 mL），用鋒利的刀片一次性快速切碎，整個過程材料需浸沒在解離液中，以便更好地游離細胞核。

（2）吸取培養皿內的解離液，用300目的濾膜過濾至1.5 mL離心管中，然后置于4 ℃冰箱中，孵育5 min。

（3）1000 r/min，離心5 min，溫度為4 ℃。

（4）棄上清后，再加入200 μL預冷的染色緩沖液，4 ℃避光染色5 min。

1.2.3 流式細胞術測定

樣品的細胞核DNA含量在南京農業大學生命科學學院實驗教學中心大型儀器共享平臺進行檢測。所用機型為美國BD（Becton, Dickinson and Company）公司生產的Accuri C6 Ⅱ流式細胞儀。光源由波長為488 nm氬離子激發，染色的DNA分子促發熒光，測定其熒光強度，與測定裝置相連的計算機分析軟件即可對熒光強度進行分析。本次實驗所有測試樣品的細胞核DNA含量是以對照為標準的相對值，每次檢測至少收集10 000個顆粒。

2 結果與分析

2.1 葡萄染色體流式細胞檢測技術體系的建立

2.1.1 解離液的篩選

流式細胞儀的結果圖中通常會出現樣本峰和碎片峰，理想的樣本峰應為左右對稱且峰型集中，而單坡峰則是碎片峰。在控制處理一致的條件下，使用上述3種解離液對葡萄葉片解離后進行流式細胞儀分析發現，經otto's（圖1A）和LB01（圖1B）處理的葡萄葉片都無法產生完整的樣本峰，葉片細胞核DNA含量少，碎片峰面積大。WPB（圖1C）對于葡萄葉片的解離效果最好，其樣本峰峰型集中，碎片峰面積小，測定結果準確。故選用WPB作為解離液。

2.1.2 FCM檢測葡萄倍性方法的建立

使用WPB解離液解離葡萄葉片后，經流式細胞儀分析樣品的細胞核情況，僅檢測到了一個峰（G1期），G1期細胞核DNA的含量可以反應細胞的倍性水平，且隨著倍性水平的增高，細胞核DNA含量增加，如二倍體‘玫瑰香’的峰值出現在橫坐標50處，三倍體‘夏黑’的峰值出現在橫坐標75處，四倍體‘巨峰’的峰值出現在橫坐標100處（圖2）。因此，可根據熒光強度的相對位置判斷葡萄品種的倍性情況。

在同一次試驗中出現如圖3所示，A峰為‘京紫晶’（2N），B峰為 ‘鄭果28號’（2N），二者DNA含量的相對熒光強度有細微的差異。這可能是由于非整倍體造成的，類似的研究也曾在香蕉上有過報道[7]。

圖1 三種解離液篩選結果Figure 1 Screening results of three dissociation solutions

圖2 三種倍性的葡萄DNA含量分布Figure 2 Nuclei DNA content of 3 different types grape ploidy

圖3 兩個二倍體葡萄品種的DNA含量Figure 3 DNA content of two diploid grape varieties

2.2 葡萄染色體的倍性分析情況

對208份葡萄品種材料檢測后，獲得了其倍性情況（表2，見文后）。

其中共有二倍體品種138個，三倍體品種11個，四倍體品種59個。其中自育品種二倍體106個，三倍體9個，四倍體47個；國外引進的品種二倍體32個，三倍體2個，四倍體12個（表3）。

2.3 葡萄染色體的倍性與果粒大小

四倍體中特大粒果的比例明顯高于二倍體和三倍體葡萄果實（表4），在同一親本不同倍性條件下，果粒大小也有顯著差別，如‘四倍體玫瑰香’的平均粒質量為7 g，‘玫瑰香’（2N）的平均粒質量為5 g；‘紅太陽’（芽變紅地球，4N）的平均粒質量為18 g，‘紅地球’（2N）的平均粒質量為12 g[8]。證明在多倍體化的過程中，葡萄的果粒也顯著增大。

3 討論與結論

對于染色體數目較多的材料，直接鑒定法難度高，且耗時長。而利用流式細胞儀能夠迅速準確地判斷葡萄倍性水平[9]。細胞核內DNA分子數目越多，DNA分子鏈越長，PI嵌入的量就越多，經激光照射，促發熒光強度越強。因此，在同一條件下，可利用DNA所發熒光強度的強弱判斷細胞核DNA含量的多少。在判斷大量樣品的倍性時，可根據已知倍性葡萄品種的峰值位置來判斷位置樣品的倍性[10]。但是利用流式細胞儀測定基因組DNA含量還存在一些問題，如樣品制備、染色、標樣等均會對測定結果產生影響，所以不易鑒別出非整倍體，如有需要可以通過細胞學進行準確鑒定。

表3 國內外葡萄品種倍性情況Table 3 Ploidy of domestic and abroad grape varieties

表4 不同倍性間果粒大小情況Table 4 Berry size among different ploidy

在本試驗統計的208個葡萄品種中，二倍體葡萄品種最多占66.3%；現代栽培的葡萄四倍體品種大多是從自然產生的突變體（芽變）衍化和秋水仙素誘導而來，故四倍體品種占比較低，為28.4%；由于利用二倍體和四倍體進行有性雜交的親和力差，雜種胚早期敗育或胚乳解體，很難獲得雜交后代。即便利用胚挽救技術也很難保證成活率，所以三倍體品種最少，僅有5.3%[11]。通過分析品種倍性與果粒大小認為，在多倍體化的過程中，葡萄的果粒也顯著增大。因此，多倍體育種是獲得大粒葡萄新品種的重要途徑之一。

表2 208個葡萄品種倍性Table 2 Ploidy of 208 grape cultivars

續表2 Continued table 2

續表2 Continued table 2

續表2 Continued table 2