HPLC法同時測定藍花參中蘆丁、橙皮苷及槲皮素的含量

張寬　曾茂貴　羅蘭　李穎　葉華　張文清

【摘 要】 目的：采用HPLC法同時測定藍花參中蘆丁、橙皮苷及槲皮素的含量，為該藥材的深入研究及資源開發提供參考依據。方法：采用HPLC-DAD法測定蘆丁、橙皮苷及槲皮素含量，檢測波長268 nm，乙腈（A）-0.5%乙酸水（B）溶液為流動相進行梯度洗脫。結果：蘆丁：y=0.128x+0.279（r=0.9970），線性范圍為3.848～48.10μg/mL;橙皮苷：y=0.101x+0.401（r=0.9965），線性范圍為4.144～82.88μg/mL;槲皮素：y=0.097x+0.007（r=0.9990），線性范圍為1.02～6.12μg/mL。結論：該法精密度、準確性良好，方法簡便快捷，可用于藍花參中蘆丁、橙皮苷及槲皮素的含量測定。

【關鍵詞】 藍花參;HPLC;蘆丁;橙皮苷;槲皮素

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）12-0042-04

Qualitative Analysis of the Rutin， Hesperidin and Quercetin from Wahlenbergia Marginata （Thunb.） A.DC. by? HPLC

ZHANG Kuan1 ZENG Maogui1 LUO Lan2 LI Ying1 YE Hua1 ZHANG Wenqing3

1.The Second Peoples Hospital of Fujian province，Fuzhou 350003，China;2.Fujian Health College，Fuzhou 350101，China;3.Fujian Provincial Governmental Hospital Fuzhou 350101，China

Abstract：Objective To provide a reference for resource development about Wahlenbergia marginata（Thunb.）A.DC.by qualitative analysis of the rutin， hesperidin and quercetin from this medicinal herb. Methods The content of rutin， hesperidin and quercetin was determined by HPLC-DAD with mobile phase of acetonitrile（A）-0.5% acetic acid（B） for gradient elution and detection wavelength of 268 nm. Result Rutin：y=0.128x+0.279（r=0.9970），linear range：3.848～48.10μg/mL; hesperidin：y=0.101x+0.401（r=0.9965），linear range：4.144～82.88μg/mL; quercetin：y=0.097x+0.007（r=0.9990），linear range：1.02～6.12μg/mL. Conclusion The method is accurate， simple and rapid， and can be used for the determination of the rutin， hesperidin and quercetin in Wahlenbergia marginata（Thunb.）A.DC.

Key words： Wahlenbergia marginata （Thunb.） A.DC.;HPLC; Rutin;Hesperidin;Quercetin

藍花參[Wahlenbergia marginata （Thunb.） A. DC.]為桔梗科藍花參屬的植物，以根或全草入藥，具有益氣健脾，祛痰止咳等功效，臨床上常用于治療感冒、氣管炎、痢疾、百日咳[1]等疾病。藥理學研究顯示：藍花參具有止咳化痰、消炎鎮痛、保肝護胃及其改善胰島素抵抗的藥理作用[2-8]。目前已知藍花參中化學成分包括甾體類、多炔類、揮發油、苯丙素類、黃酮類及萜類化合物[4，9-16]。其中周向文[4]從藍花參醇提取物中分離出單體化合物，后經過波譜學分析并鑒定單體化合物8個，其中五個化合物為黃酮類，包括farobin B、異牡荊素、蘆丁、3′-甲氧基-5，7-二羥基黃酮-6-C-波伊文糖-4′-O-葡糖糖苷和異牡荊素2′′-O-鼠李糖苷。而課題組的前期研究工作則首次采用液質聯用技術對藍花參進行分析，初步鑒定了藍花參中的6個化學成分，均為黃酮類，分別是紫云英苷、蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮苷、槲皮素、芹菜苷[15-16]，說明黃酮類成分為藍花參主要成分之一。鑒于多指標綜合評價藥材質量能在一定程度能更全面且準確的對藥材進行質量控制，課題組建立HPLC法同時測定藍花參中蘆丁、橙皮苷及槲皮素含量方案，為藍花參的資源開發及質量控制提供參考依據。

1 實驗材料

1.1 儀器 戴安U3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）; SinoChrom ODS-BP色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）;SB4200DT超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）;BT125D電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.2 試藥 藍花參全草干品（批號：14010507，福州回春中藥飲片廠有限公司）經福建衛生職業技術學院藥學系朱扶蓉副教授鑒定為[Wahlenbergia marginata （Thunb.） A.DC.]。蘆丁對照品（批號：100080-201610）、槲皮素對照品（批號：100081-201509）、橙皮苷對照品（批號：110721-201115）購于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗 流動相乙腈（A）-0.5%乙酸水（B），梯度洗脫（0～5min，10%～15%A;5～10min，15%～17%A;10～20min，17%～20%A;20～30min，20%～20%A;30～40min，20%～30%A;40～45min，30%～40%A;45～55min，40%～60%A;55～60min，60%～10%A;60～65min，10%～10%A）;流速：1mL/min;檢測波長268nm;柱溫25℃;進樣量10μL，見圖1。

2.2 對照品溶液制備 精密稱定蘆丁標準品9.620mg、橙皮苷標準品10.36mg、槲皮素標準品10.20mg，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，得到濃度分別為0.9620、1.036、1.020mg/mL的對照品貯備液。精密吸取各對照品貯備液適量于同一量瓶中，甲醇稀釋得混合對照品溶液（濃度分別為19.24、41.44、10.20μg/mL）。

2.3 供試品溶液制備 精密稱定藍花參藥材約2.0g，加入40%乙醇50mL，精密稱定，超聲30min，取出，放至室溫，補足重量，0.22μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 標準曲線制備 分別精密量取蘆丁、橙皮苷、槲皮素標準品溶液適量，稀釋成一系列各標準品溶液，按2.1項下色譜條件測定，以各對照品溶液濃度（C）為橫坐標x，峰面積（A）為縱坐標y，得回歸方程。蘆丁：y=0.128x+0.279（r=0.9970），線性范圍為3.848～48.10μg/mL;橙皮苷：y=0.101x+0.401（r=0.9965），線性范圍為4.144～82.88μg/mL;槲皮素：y=0.097x+0.007（r=0.9990），線性范圍為1.02～6.12μg/mL。

2.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10μL，按2.1項下色譜條件連續進樣6次。蘆丁、橙皮苷、槲皮素峰面積RSD分別為0.19%，0.37%，0.50%，表明該儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 精密稱定藍花參藥材約2.0g，按2.3項下制備供試品溶液，于0、1.5、3，6、9、12h，按2.1項下色譜條件進樣。蘆丁、橙皮苷、槲皮素峰面積RSD分別為0.61%、0.51%、1.54%，說明該供試品在12h內穩定。

2.1.7 重復性試驗 精密稱定藍花參藥材約2.0g共6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。蘆丁的平均含量為511.418μg/g，RSD為0.59%;橙皮苷的平均含量為698.209μg/g，RSD為0.47%;槲皮素的平均含量為118.184μg/g，RSD為0.76%。說明該方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取同批藍花參藥材6份，每份1.0g，均精密加入蘆丁、橙皮苷、槲皮素混合對照品溶液適量，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣。蘆丁、橙皮苷、槲皮素的平均加樣回收率分別為99.68%、97.63%、98.71%，RSD分別為1.61%、1.39%、1.45%。說明該方法準確性高，見表1至表3。

2.9 樣品測定 精密稱取藍花參2g，按照上述實驗條件平行測定三份。實驗結果：蘆丁、橙皮苷、槲皮素含量的平均提取量分別為480.243、780.552、132.469μg/g，三次驗證試驗的RSD分別為0.81%、0.62%、1.2%。

3 討論

由于乙醇對黃酮類成分的溶解性高[17]，有助于有效成分的提取，故本次實驗采用乙醇作為溶媒對藍花參中的黃酮類成分進行提取。通過查閱文獻發現，甲醇-0.03%甲酸水、乙腈-0.2%乙酸水、甲醇-0.1%甲酸水均可作為同時測量蘆丁、橙皮苷及槲皮素含量的流動相。故實驗中考察了上述流動相條件，通過對比發現乙腈-0.2%乙酸水的色譜峰分離度及峰形相對較好，對洗脫條件進一步優化，最終選擇乙腈-0.5%乙酸水梯度洗脫。

課題組前期對藍花參提取條件進行考察，考察內容包括乙醇濃度、提取時間和料液比3個參數，結果顯示：用40%乙醇在料液比為1∶25的條件下超聲30min，藍花參中化學成分提取效果最優，所以本文對藍花參提取采用該參數進行供試品溶液制備。

查閱文獻可知，部分中藥材的黃酮類成分具有止咳化痰的作用[18-21]，與藍花參的用法功效不謀而合，課題的前期藥理學研究也說明藍花參在止咳化痰方面具有良好效果[22]，在本次實驗基礎上，下一步擬探討已知化學成分與藥效之間關系，為闡明藍花參止咳化痰藥效物質基礎研究奠定依據。

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