LncRNA-MEG3作為急性髓系白血病預后標志物調控細胞增殖

曾進龍　周志衡　陳寶欣　王彩霞

【摘要】 目的：探索長鏈非編碼-MEG3（LncRNA-MEG3）與急性髓系白血?。ˋML）生存期的關系，并分析它對細胞增殖的調控作用。方法：采用過表達技術對AML細胞系HL-60、THP-1和U937的LncRNA-MEG3進行過表達，用MTT檢測細胞增殖情況。收集初發未治的10例AML患者和10名健康人的骨髓標本及相關臨床資料，用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測LncRNA-MEG3在骨髓中的表達情況。檢測75例被確診為AML患者骨髓中LncRNA-MEG3的表達情況，并跟蹤隨訪5年，分析LncRNA-MEG3的表達與患者生存結局的關系。結果：與健康人比較，AML患者骨髓中LncRNA-MEG3的表達量明顯下調，差異有統計學意義（P<0.01）。生存分析顯示，MEG3低表達組患者的中位生存時間為21.162個月，明顯短于MEG3高表達組的41.715個月（P<0.000 1）。MTT結果顯示，LncRNA-MEG3過表達細胞組的細胞增殖明顯低于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：LncRNA-MEG3在AML骨髓中表達下調，LncRNA-MEG3低表達可能是AML預后不良的新生物標記物，并能調控AML細胞的細胞增殖。

【關鍵詞】 急性髓系白血病; 長鏈非編碼RNA; 細胞增殖; 生物標志物

LncRNA-MEG3 as a Prognostic Marker of Acute Myeloid Leukemia Regulates Cell Proliferation/ZENG Jinlong，ZHOU Zhiheng，CHEN Baoxin，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（23）：00-005

【Abstract】 Objective：To explore the relationship between long-chain non-coding-MEG3（LncRNA-MEG3）and the survival period of acute myeloid leukemia（AML），and to analyze its regulatory effect on cell proliferation.Method：LncRNA-MEG3 of AML cell lines HL-60，THP-1 and U937 were overexpressed by overexpression technique，and the proliferation of the cells was detected by MTT.Bone marrow samples and relevant clinical data of 10 untreated AML patients and 10 normal people were collected，and the expression of LncRNA-MEG3

in bone marrow was detected by real-time quantitative PCR（qPCR）.The expression of LncRNA-MEG3 in the bone marrow of 75 patients diagnosed with AML was detected and followed up for 5 years to analyze the relationship between the expression of LncRNA-MEG3 and survival outcome of patients.Result：Compared with healthy individuals，the expression of LncRNA-MEG3 in bone marrow of AML patients was significantly down-regulated，the difference was statistically significant（P<0.01）.Survival analysis showed that the median survival time of patients in the MEG3 low-expression group was 21.162 months，significantly shorter than 41.715 months in the MEG3 high-expression group（P<0.000 1）.MTT results showed that the proliferation of LncRNA-MEG3 overexpressed cells in the LncRNA-MEG3 overexpressed cells group was significantly lower than that in the negative control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The expression of LncRNA-MEG3 in AML bone marrow is down-regulated，and the low expression of LncRNA-MEG3 may be a new biomarker of AML with poor prognosis，and can regulate the proliferation of AML cells.

【Key words】 Acute myeloid leukemia; Long non coding RNA; Cell proliferation; Biomarker

First-authors address：Zengcheng District Peoples Hospital of Guangzhou，Guangzhou 511300，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.23.001

母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是小鼠母體印記基因Gtl2的人類同系物，定位于染色體14q32.3，屬于長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）。有研究發現，MEG3在多種正常組織中表達，但在很多腫瘤細胞中表達下調或者表達缺失[1]。MEG3可能是腫瘤發生發展的新生物標記物[2-3]，但它在血液腫瘤中的功能如何，仍未被闡明。本研究擬探索長鏈非編碼LncRNA-MEG3與急性髓系白血病生存期的關系，并分析它對細胞增殖的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞系 白血病細胞株HL-60、THP-1和U937由廣州賽哲生物科技有限公司實驗室饋贈。培養體系為含10%胎牛血清的1640培養液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.1.2 主要試劑與儀器 TRIzol（Gibco公司），PCR引物、PCR內參照引物（上海生工公司），逆轉錄試劑盒Fermentas K1622，TurboFect Transfection Reagents（Thermo Scientific），qPCR試劑盒（Promega公司）pcDNA3.0空載體和pcDNA3.0-MEG3質粒（上海吉瑪制藥有限公司），Ficoll（GE公司）。

1.1.3 患者來源 （1）檢測LncRNA-MEG3差異表達的患者來源：2018年8月1日-10月30日在本院初發未治急性髓系白血病（AML）10例，患者均符合FAB診斷標準，其中男5例，女5例，年齡21～67歲，平均（34.40±4.12）歲;選取10名健康人作為健康對照組，其中男5例，女5例，年齡21～65歲，平均（34.10±3.91）歲。（2）生存分析的入組患者來源：根據FAB的診斷標準，選取本院于2012年2月-2013年12月在廣州市第一人民醫院確診的75例AML患者標本庫標本作為入組對象，收集這些患者的骨髓標本和相關臨床資料，并對其進行隨訪。自確診之日至死亡或最后隨訪截止日計算其生存時間，終點隨訪時間為2018年12月30日，隨訪時間均超過5年。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取及純度和含量的鑒定 取1×106個MNCs用Trizol提取細胞總RNA，在1.8%瓊脂糖電泳下可見三條清晰亮帶（28S、18S、5S），證明所提RNA模板完整;用紫外分光光度計測定A260/A280比值均大于1.8，并進行RNA含量測定。

1.2.2 pcDNA3.0 MEG3質粒的細胞轉染 細胞實驗分為對照組、空載體組、MEG3質粒組。對照組細胞僅加轉染試劑，空載體組轉染pcDNA3.0質粒，MEG3質粒組轉染pcDNA3.0-MEG3質粒。細胞培養獲得對數生長期的細胞，接種于6孔板中，用Lipfectamine2000轉染pcDNA3.0-MEG3，以轉染空載體pcDNA3.0和未轉染細胞作為對照，轉染

24～48 h后，檢測各組細胞LncRNA-MEG3表達水平。

1.2.3 細胞增殖實驗 按照5 000個/mL的細胞密度接種于96孔板，每孔200 μL，每組設3個復孔，置于5% CO2、37 ℃培養箱中靜置培養;細胞處理：U937、HL-60和THP-1細胞分別轉染siRNA-NC、siLncRNA-MEG3，實驗重復三次;培養結束前4 h，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續置于37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養至結束;收集細胞并重懸，每孔加入150 μL DMSO，水平振蕩10 min，酶標儀檢測492 nm處的吸光值，繪制生長曲線。

1.2.4 人單個核細胞（mononuclear cells，MNCs）提取 白血病患者和健康人標本均為肝素抗凝新鮮骨髓，PBS稀釋后，置于淋巴細胞分離液Ficoll上，在自動平衡離心機上1 500 r/min（Eppendorf，美國）離心20 min，吸取界面層MNCs，PBS洗滌2次，所得MNCs一部分用作抽提總RNA。

1.2.5 qPCR檢測LncRNA-MEG3表達情況 各細胞的總RNA運用Fermentas K1622試劑（Thermo Scientific公司）逆轉錄為cDNA。逆轉錄為cDNA后，根據試劑說明書配置QPCR體系（20 μL）：2×Master Mix（10 μL），Forward Primer（10 μM）（0.3 μL），Reverse Primer（10 μM）（0.3 μL）（序列：Forward：5-ATCCGTCCACCTTGTCT-3，Reverse：5-CCTCTTCATCCTTTGCCATC-3），cDNA（0.8 μL），nuclease-free Water（8.6 μL）。每樣品每基因重復3次。在ABI Stepone Plus qPCR儀上設置QPCR反應程序：95 ℃，5 min;95 ℃，30 s;58 ℃，30 s，40個循環;72 ℃，15 s，95 ℃，15 s;60 ℃，1 min;95 ℃，15 s。

1.3 統計學處理 運用SPSS 19.0統計軟件建立數據庫并進行統計分析。符合正態分布的計量資料用（x±s）描述，比較用獨立樣本的t檢驗，三個時間點重復測量的MTT結果采用重復測量設計的方差分析。應用K-M法和生命表法計算中位生存率和累計生存率;運用對數秩檢驗（Log-rank）比較不同組的生存時間差異，雙側ɑ=0.05作為檢驗水準。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般情況 本研究入組的急性髓細胞白血病患者75例，按照FBA分型M1、M2、M3、M4、M5分別是5、18、12、15、25例，M6、M7均為0例。其中男41例，女34例，年齡18～68歲，平均（34.20±4.12）歲。

2.2 白血病患者與健康對照組MNC細胞LncRNA-MEG3的表達 健康人骨髓MNC細胞LncRNA-MEG3表達量為4.759±1.719，而AML患者骨髓MNC細胞LncRNA-MEG3表達量為1.109±0.362。與健康人比較，AML患者的骨髓標本中LncRNA-MEG3的表達明顯下調，差異有統計學意義（t=-6.684，P<0.001），見圖1。

2.3 LncRNA-MEG3表達與AML患者預后生存期的關系 75例AML患者，中位生存時間為31.577個月，有20例（26.67%）患者達5年或5年以上長期生存。以LncRNA-MEG3表達量1.0為截點，把AML患者分為MEG3低表達組（37例）和高表達組（38例）。MEG3低表達組患者的生存時間2～60個月，中位生存時間為21.162個月，有3例（8.108%）患者的生存期5年以上;而MEG3高表達組患者的生存時間為1～60個月，中位生存時間為41.715個月，有17例（44.737%）患者的生存期5年以上。經對數秩檢驗（Log-rank）分析，MEG3高表達組的5年生存率（44.737%）和MEG3低表達組患者的5年生存率（8.108%）比較，差異有統計學意義（字2=19.117，P<0.000 1），見圖2。

2.4 各細胞系LncRNA-MEG3過表達效果 HL-60、

THP-1和U937細胞分別用pcDNA3.0-MEG3和空載體pcDNA3.0轉染48 h后，分別檢測未轉染細胞、空載體pcDNA3.0轉染細胞和pcDNA3.0-MEG3轉染細胞的LncRNA-MEG3表達水平。結果顯示，

以上三種細胞被空載體pcDNA3.0轉染后，LncRNA-MEG3表達量分別是（0.56±0.10）、（0.62±0.12）和（0.39±0.07）;而被pcDNA3.0-MEG3轉染后，以上三種細胞的LncRNA-MEG3表達量分別（5.78±0.58）、（6.42±1.21）和（5.15±0.77），pcDNA3.0-MEG3轉染細胞的LncRNA-MEG3表達量明顯上調，達到了過表達的效果。

2.5 AML細胞系中LncRNA-MEG3對細胞增殖的調控作用 在不同細胞系中，與pcDNA3.0空載體轉染細胞比較，pcDNA3.0-MEG3轉染細胞增殖受抑制。其中，HL-60和THP-1細胞系在轉染24 h起，pcDNA3.0-MEG3轉染細胞增殖（ODHL-60=0.214，ODTHP-1=0.231）低于pcDNA3.0空載體轉染細胞（ODHL-60=0.315，ODTHP-1=0.325），差異有統計學意義（P<0.001），而U937細胞在轉染48 h pcDNA3.0-MEG3轉染細胞增殖（OD=0.423）低于pcDNA3.0空載體轉染細胞（OD=0.645），差異有統計學意義（P<0.001），見圖3。

3 討論

近年來，LncRNA在腫瘤發病和預后的研究備受關注。LncRNA是繼miRNA之后被科學家們重點研究的熱點之一[4]。前期的研究證明，LncRNA在多種腫瘤中存在異常表達的現象，并在腫瘤發生和發展中起重要作用[5]。有研究顯示，LncRNA在急性和慢性病白血病中也存在表達異?，F象，并具有重要的調控功能[6-7]：LncRN-MIR100HG和As MONC參與了急性巨核細胞白血病的發生與發展[8]，LncRNA NEAT1在急性早幼粒細胞白血病中的表達明顯低于健康人的表達[9]，LncRNA-ANRIL在急性淋巴細胞白血病中能調節p16INK4a;LncRNA急性髓性白血病中能參與沉默p15和p21基因。本課題在過去的研究也發現，LncRNA-H19、LncRNA-ENST00000414355在AML中具有調控細胞周期和細胞凋亡的作用，并與部分臨床指標具有相關性。

目前，LncRNA在肝癌、肺癌等腫瘤的研究較多，而在白血病的研究報道有限[10-12]。特別是LncRNA在急性白血病中發生發展中的調控、與治療和預后的研究仍處于起步階段?；诖耍卷椖拷M開展了LncRNA-MEG3與AML生存時間的關系，并研究LncRNA-MEG3對AML細胞系的細胞增殖調控作用。本研究發現，AML患者骨髓單核細胞的LncRNA-MEG3表達量顯著下調;AML患者中，骨髓單核細胞的LncRNA-MEG3表達量下調組的患者生存時間較LncRNA-MEG3高表達組的短。在三種急性白血病細胞系中，LncRNA-MEG3過表達細胞組的細胞增殖情況明顯低于pcDNA3.0空載體轉染組。以上結果提示，LncRNA-MEG3與AML發病和預后相關，并具有調控AML細胞增殖的功能。

既往大量的研究發現，LncRNA-MEG3在乳腺癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤中呈現低表達的現象，同時還發現LncRNA-MEG3能抑制部分腫瘤細胞增殖的作用[13-16]，MEG3可能是一種腫瘤抑制因子，可通過增強P53基因的活性而發揮調控作用[17-18]。然而，LncRNA-MEG3在急性髓系白血病中的調控功能如何、它的表達與該病的預后關系如何？調控機制如何？[19-20]尚未被闡明。本研究發現，LncRNA-MEG3在急性白血病中調控細胞增殖的功能，并發現LncRNA-MEG3低表達的患者生存時間較短，這提示LncRNA-MEG3可能是急性髓系白血病預后的一個新生物標志物，這和文獻[21]報道LncRNA-MEG3在其他腫瘤的調控功能吻合。今后，筆者將繼續擴大臨床樣本量和進一步延長患者的跟蹤隨訪時間和增加觀察指標，進一步驗證LncRNA-MEG3在急性白血病中作為新生物標記物的效果，并深入探索LncRNA-MEG3的調控機制，為闡明LncRNA-MEG3在急性白血病預防、診斷和治療的角色提供新思路。

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（收稿日期：2019-03-19） （本文編輯：張爽）