Cd脅迫下小麥的形態生理響應及Cd積累分布特征

張大眾，楊海川，菅明陽，隗書偉，趙 越，張一陽，丁 勤，馬翎健*

（1.西北農林科技大學農學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100；3.河北省石家莊市藁城區農業科學研究所，石家莊 052160）

鎘（Cd）在土壤中有高度的遷移性，是最具有危害性的重金屬元素之一[1]。Cd可通過食物鏈傳遞進而危害人的身體健康。小麥是我國主要糧食作物之一，且屬于抗Cd能力較強和易積累作物[2]。Cd脅迫會導致小麥株高、穗長和產量等生長指標降低以及品質的下降。大量試驗表明[3-4]小麥Cd抗性存在較大的品種間差異。小麥Cd抗性又可以分為耐性（高濃度Cd條件下減小其毒害）和避性（減少吸收量）兩個途徑。早期研究也多是圍繞這兩個途徑展開，一方面研究Cd脅迫對小麥形態生理指標的影響[5-7]和Cd積累分布特征，研究表明SOD、POD、CAT等保護性酶及脯氨酸、可溶性糖等滲透調節物質與小麥Cd耐受能力相關，Cd在根部等器官和組織的特異積累能提高小麥Cd耐受能力；另一方面是低積累品種的篩選[8-9]。近年通過調控環境因素來降低Cd脅迫對小麥毒害作用的相關的研究逐漸增多[10-12]。從小麥自身Cd抗性出發并系統研究小麥在Cd脅迫下的形態生理響應，Cd的吸收、積累分布特征以及不同抗性品種之間響應方式差異的報道很少，單一水平揭示小麥Cd脅迫的響應機制，不利于小麥Cd抗性的深入研究及相關性狀的改良。本研究通過比較不同濃度Cd處理及不同Cd抗性小麥品種間對Cd脅迫的形態、生理響應以及Cd的積累、轉運和化學形態分布，試圖初步探討小麥的Cd抗性機制，為小麥高抗和低積累Cd性狀的遺傳改良提供參考。

1 材料方法

1.1 試驗材料

盆栽試驗用土取自西北農林科技大學試驗田，風干后過篩并與營養土按一定比例混勻。土壤理化性質：pH 8.0，速效氮 112.4 mg·kg-1，速效磷 38.2 mg·kg-1，速效鉀87.9 mg·kg-1，Cd 0.52 mg·kg-1。

試驗所選用小麥品種為課題組前期通過發芽試驗篩選出的Cd抗性不同但生育期基本一致的黃淮麥區小麥品種（系），發芽率和發芽勢顯示其抗性水平為：許農186較高，M1019和漯麥0603中等，西農20較低。

1.2 試驗處理

外源Cd 含量設置0、25、50 mg·kg-13個水平，按照相應處理濃度及土壤質量稱取CdCl2·2H2O溶于水中噴于土壤表面并不斷攪拌混勻。將處理后的土壤裝入塑料盆中，每盆裝土8 kg，澆足水穩定30 d備用。各品種種子用30%H2O2消毒20 min后再用蒸餾水多次沖洗。將消毒后的種子種于裝滿相應濃度Cd處理土壤的營養缽（10 cm×10 cm×10 cm）中，每盒種60粒，每個處理2盒，共24盒。于恒溫25℃、光照12 h的培養箱進行培養，長至一葉一心轉移到3～4℃的培養箱春化一個月。苗期移苗到對應Cd濃度的塑料盆中，每盆10株，每處理5盆，共60盆，在日光溫室培養至成熟。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 形態指標調查

于成熟期測量株高，頂三葉面積（長×寬×0.75），莖、葉、穗干質量（10株）和千粒重（500粒）。

生長抑制率=（1-處理/對照）×100%

1.3.2 生理指標測定

（1）分別于苗期（苗期移苗時）、拔節期、灌漿期和蠟熟期取小麥頂部三片葉，存放于-80℃冰箱，測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及脯氨酸含量。因種子數量的原因，苗期所取樣品量較少，未進行該時期SOD酶活性測定。

（2）分別于拔節期、開花期、灌漿期用葉綠素儀（SPAD502）測量小麥頂三葉葉綠素相對含量。

1.3.3 Cd的積累分布測定

（1）小麥各器官Cd積累量

于成熟期按處理取樣，用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗三次，吸水紙吸干表面水分，根部在20 mmol·L-1的Na2-EDTA溶液浸泡15 min除去表面的Cd。按根、莖、葉、籽粒分解，并于75℃烘干至恒質量，籽粒陰干，各處理樣品粉碎過100目篩并稱取1 g用石墨消解儀消解，消解試劑為HNO3-HClO4（3∶1，V/V），用火焰石墨爐原子吸收光譜儀（Z-2000）測定Cd含量。

（2）小麥體內Cd化學形態分析

于小麥灌漿期取各處理根和葉片用于化學形態分布測定。Cd化學形態分析采用化學試劑連續提取的方法[13]。

1.4 數據處理分析

本試驗的所有數據均使用Excel 2007和SPSS 19軟件進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 Cd處理對小麥表型性狀的影響

不同濃度Cd處理下各小麥品種的表型性狀如表1所示。許農186和西農20株高未隨Cd處理濃度的增加而顯著變化，M1019在25 mg·kg-1處理下株高有所增加，而漯麥0603在50 mg·kg-1處理下與對照相比株高顯著降低。各品種莖、葉、穗干質量和千粒重隨Cd處理濃度的增加而降低，其中對葉片干質量影響最大，50 mg·kg-1處理下降20%以上；25 mg·kg-1處理下許農186、西農20和M1019的頂三葉葉面積分別增大了8.6%、2.9%和7.21%，50 mg·kg-1處理下葉面積均顯著減小，其中漯麥0603降低最多為11.9%。各品種受抑制程度隨處理Cd濃度增加而增加，在25 mg·kg-1和50 mg·kg-1兩個處理下許農186平均抑制率最低，漯麥0603最高，西農20和M1019抑制率居中。

2.2 Cd處理下小麥的生理響應

2.2.1 POD酶活性

由圖1可以看出各處理下小麥葉片POD酶活性隨處理時間的延長整體上呈降低趨勢。苗期各品種小麥葉片POD酶活性整體呈現隨Cd處理濃度升高而增加的趨勢，其中許農186葉片POD酶活性最高，M1019最低。拔節期各處理葉片POD酶活性在各時期中最低，西農20和M1019葉片POD酶活性仍隨Cd濃度的上升而顯著增加，且西農20的POD酶活性在50 mg·kg-1條件下在同時期所有處理中最高；許農186和漯麥0603的葉片POD酶活性隨Cd濃度的上升而顯著降低，且漯麥0603在同時期所有處理中酶活性處于較低水平，在50 mg·kg-1條件下達到最低。灌漿期和蠟熟期各處理葉片POD酶活性在25 mg·kg-1條件下最高，50 mg·kg-1條件下酶活性則顯著低于25 mg·kg-1下的水平，這兩個時期各品種在對應Cd脅迫條件下POD酶活性以西農20最高，漯麥0603最低。

表1 不同濃度Cd處理下各小麥品種農藝性狀Table 1 Agronomic traits of wheat varieties under different concentrations of Cd

2.2.2 SOD酶活性

如圖2所示，除漯麥0603拔節期和灌漿期葉片SOD酶活性隨Cd處理濃度增加而增加外，其余各處理SOD酶活性均隨Cd處理濃度增加而降低，但較多處理間SOD酶活性差異不顯著。蠟熟期SOD酶活性低于灌漿期。

2.2.3 脯氨酸含量

由圖3可知，脯氨酸含量整體上隨Cd處理時間和處理濃度的增加呈上升趨勢，但增加幅度較小，多數處理之間差異不顯著。

2.2.4 葉綠素含量

各處理下不同時期頂三葉葉綠素含量的平均值如圖4所示。許農186、西農20和M1019頂三葉葉綠素含量隨生育進程的推進而升高并趨于穩定，而漯麥0603在灌漿期葉綠素含量顯著下降。小麥各品種各時期葉綠素含量均隨Cd處理濃度的增加而降低。灌漿期25 mg·kg-1和50 mg·kg-1處理條件下各品種葉綠素含量顯著低于對照，且漯麥0603各處理間差異顯著。

2.3 各品種小麥Cd積累特征

圖5表明，Cd在四個品種小麥各器官中的含量隨Cd處理濃度的增加而升高，不同器官中Cd含量表現為：根＞葉片＞莖稈＞籽粒，且地上各部位遠低于根，籽粒中的Cd含量遠低于其他部位，50 mg·kg-1條件下籽粒中的Cd含量只占根部的2.2%～3%。西農20和漯麥0603各器官Cd積累量均顯著高于許農186和M1019。品種間不同部位Cd含量比值也表現出明顯差異，50 mg·kg-1處理下漯麥0603 Cd的葉片和籽粒轉運系數最低，分別為21.2%和2.2%，西農20葉片轉運系數最高，分別為26.4%，西農20和許農186籽粒轉運系數較高，分別為3.02%和3.04%。

2.4 各品種小麥Cd化學結合形態

圖1 各處理下不同生育時期小麥葉片POD酶活性Figure 1 POD enzyme activity of wheat leaves at different growth stages under different treatments

圖2 各處理下不同生育時期小麥葉片SOD酶活性Figure 2 SOD enzyme activity of wheat leaves at different growth stages under different treatments

小麥葉片各提取態Cd含量如圖6所示。未處理條件下Cd各提取態間的分布相對均勻，隨Cd處理濃度的增加氯化鈉提取態和醋酸提取態占比增大，其余結合形態占比逐漸減小。未處理條件下氯化鈉提取態和醋酸提取態占比20%左右，其余化合態略低于上述兩種狀態。25 mg·kg-1脅迫條件下氯化鈉提取態和醋酸提取態分別占40%和30%左右，其余形式各占10%左右。50 mg·kg-1脅迫條件下氯化鈉提取態和醋酸提取態分別占50%和30%左右，其余形式都在10%以下。各品種的活躍態（乙醇、去離子水和氯化鈉提取態）Cd的比例有所差異，各處理條件下西農20和漯麥0603相近且活躍態Cd占比較高，許農186活躍態Cd占比最低。

圖3 各處理不同生育時期葉片脯氨酸含量Figure 3 Proline content in leaves of different growth stages

小麥根系各提取態Cd含量如圖7所示。分布情況與葉片中分布情況相似，但各處理下氯化鈉提取態和醋酸提取態Cd占比提高。

圖4 各處理不同時期頂三葉葉綠素含量相對值Figure 4 Chlorophyll content of top three leaves in different periods of treatment

3 討論

圖5 各處理小麥不同器官Cd積累量Figure 5 Cd accumulation in different parts of wheat under different treatments

圖6 小麥葉片各提取態Cd含量分配比例Figure 6 The percentage of each extractable forms of Cd in leafs of wheat

小麥不同表型性狀對Cd脅迫的響應存在差異，25 mg·kg-1濃度Cd處理下對M1019的株高及西農20、許農186和M1019葉面積有促進作用，即適宜濃度Cd脅迫對部分小麥的株高和葉片的生長有促進作用，這與何俊瑜等[14]和王麗燕等[15]在Cd脅迫對小麥種子萌發及幼苗生長實驗中的結果相似，與聶勝委等[16-17]在Cd脅迫對小麥生長及產量研究中的結果基本一致，朱志勇等[18]的研究也表明50 mg·kg-1Cd處理下仍能促進抗性小麥品種葉面積指數的增加，本試驗中許農186葉面積在50 mg·kg-1Cd處理下與對照差異不顯著。本試驗中在葉面積增加的情況下相應處理的小麥各器官干質量仍下降，可能是由于光合機構對Cd脅迫更為敏感，致使光合速率顯著下降，同化物質減少[19-20]。Cd脅迫還能抑制籽粒貯藏物質合成能力和胚乳細胞的分裂能力，導致籽粒庫容量減少，千粒重下降[21]。從表型性狀受抑制的程度可以看出四個品種Cd抗性表現為許農186較強，M1019、西農20次之，漯麥0603最弱，這與前期鑒定的結果基本一致。個別品種抗性的變化可能是因為不同生育時期抗性不一致。

圖7 小麥根系各提取態Cd含量分配比例Figure 7 The percentage of each extractable forms of Cd in roots of wheat

Cd對植物的毒害作用之一是損害生物體內的酶及其化學性質并誘發高活性自由基[22-23]。SOD、POD等是活性氧自由基清除系統中的重要保護酶。本試驗中，POD在苗期活性較高，隨后活性迅速降低，且隨脅迫時間延長呈降低趨勢，在灌漿和蠟熟期25 mg·kg-1Cd脅迫下POD酶活性最高。許農186、西農20和M1019的SOD酶活性隨Cd濃度的增加和脅迫時間的延長不斷降低。可能是因為SOD和POD活性的提高是一種急性解毒措施，其調節能力是臨時和有限的，當細胞長時間受到脅迫，細胞內的酶也會受到損傷而使活性下降[24]。脯氨酸在植物體內含量可以反映植物受脅迫程度的大小[25]，本試驗中脯氨酸含量整體上隨Cd處理濃度和時間的增加而增加，即隨著處理濃度和時間的增加小麥受脅迫的程度也不斷增加。本試驗中SOD、POD酶活性和脯氨酸含量既表現出了相同的規律性也有品種間的差異，其中許農186和西農20的SOD、POD酶活性各時期都高于漯麥0603，西農20的脯氨酸含量相對較高，而漯麥0603一直處于較低水平，這些抗性生理對Cd脅迫響應程度的差異也是造成品種間Cd抗性差異的重要原因，這與何俊瑜等[26]的觀點一致。Cd脅迫對葉綠素含量和光合作用也有很大程度的影響，葉綠素含量高低也可以用來反映植物逆境下受傷害的程度。本試驗中，隨Cd處理濃度的增加，葉綠素含量下降。拔節期頂三葉葉綠素含量低是因為頂部新抽出葉片光照時間短，葉綠素含量低。各品種以漯麥0603各處理間葉綠素含量差異最大，說明該品種對Cd脅迫最敏感。

Cd脅迫下小麥各個器官Cd含量隨處理濃度的升高而升高，不同器官含量不同[27-28]。本試驗研究結果與文獻一致，小麥各器官Cd含量表現為根部＞葉片＞莖稈＞籽粒，與肖昕等[27]和馮紹元等[29]研究結果一致。Cd積累量在品種間表現出差異，西農20和漯麥0603顯著高于許農186和M1019，說明西農20和漯麥0603應對Cd脅迫的避性要低于許農186和M1019；不同器官間分配比例也不同，根系和莖稈中漯麥0603 Cd含量最高，葉片和籽粒中則是西農20含量最高。減少Cd的吸收，限制向地上部的轉運是植物應對Cd脅迫的重要防御方式[30]。西農20表現出較高的Cd吸收和轉運能力，是Cd抗性低的表現。漯麥0603則是高吸收、低轉運，但其葉片和籽粒的絕對含量仍處于較高水平。

植物體內的重金屬以不同的化學結合形態存在，其中乙醇提取態和水溶態遷移活性最強，氯化鈉提取態次之，醋酸和鹽酸提取態最弱[13]。無論在葉片還是根部乙醇提取態和水溶態Cd占比都隨處理Cd濃度的增加而降低，氯化鈉和醋酸提取態不斷增加。在葉片中許農186的乙醇提取態和水溶態占比最少，漯麥0603占比最多，根中的分布情況與葉片相似。說明漯麥0603中活性高的Cd占比較多，在該方面對Cd的抗性較弱。

許農186低吸收Cd，高活性的Cd的組分占比最少，生理響應水平相對高，所以表現出了較高的Cd抗性；漯麥0603高吸收Cd，高活性Cd組分占比多，生理響應水平低，所以表現出了較低的Cd抗性；西農20和M1019的各個指標響應程度有強有弱，所以其抗性處于中間水平。從以上結果可以看出，小麥響應Cd脅迫的防御方式很多，響應方式也不盡相同，而抗性是所有生理機制作用的綜合體現。

4 結論

（1）四個小麥品種成株期Cd抗性表現為：許農186抗性高，西農20和M1019次之，漯麥0603較低。Cd脅迫在各器官中以對葉片干質量的影響最大，一定濃度的Cd脅迫對部分小麥品種的株高和葉面積等有促進作用。

（2）一定程度的Cd脅迫能提高POD酶活性，脅迫程度過高則表現為抑制，敏感型品種酶活性低；長時間Cd脅迫會降低SOD酶活性；脯氨酸含量隨Cd處理濃度和時間的增加而增高；葉綠素含量在Cd脅迫下降低。

（3）隨Cd處理濃度的增加，小麥通過提高低活性Cd的比例，來提高自身抗Cd脅迫的能力。

（4）不同小麥品種Cd吸收積累和分布的特征不同，對Cd脅迫的響應也不同，但整體上表現為：抗性品種的Cd吸收量小、高活性Cd占比小、生理響應的水平高。