黃土高原潛在缺鋅區施用納米氧化鋅（ZnO NPs）對冬小麥生長及籽粒品質的影響

孫宏達，鐘民正，張 騰，翟丙年，王朝輝，毛 暉*

（1.西北農林科技大學資源環境學院，陜西 楊凌 712100；2.農業部西北植物營養與農業環境重點實驗室，陜西 楊凌 712100；3.南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095）

鋅是人體必需的微量元素之一，對于哺乳動物的生長發育至關重要。它影響多種酶的活性，促進核酸代謝和蛋白質的合成、促進膠原纖維的合成、促進機體的新陳代謝、增強機體的免疫能力等，一旦人體內缺鋅則會造成一系列的疾病與危害[1]。目前鋅營養缺乏也是世界上公認的公共衛生問題，造成了嚴重的健康和社會經濟問題，也引起了生命科學等方面的關注，被列為需首要解決的問題[2]。鋅的攝入量低是人體廣泛缺鋅的主要原因[3]，通過科學的膳食結構和合理的補鋅措施來維護身體鋅水平以應對缺鋅引起的人體健康問題的研究方向在這一領域成為共識。

小麥是我國三大糧食作物之一，尤其是黃土高原地區主要的作物類型。已有研究結果表明：我國目前小麥籽粒鋅含量平均值為24～33 mg·kg-1[4-6]，顯著低于小麥籽粒鋅含量40～60 mg·kg-1的推薦值[7-8]，所以小麥籽粒增鋅成為迫切需要解決的問題。傳統的作物增鋅方式主要有育種改良（例如遺傳生物強化）和施用鋅肥（例如農藝生物強化）兩種途徑[9]。育種改良可以提供持續的改善效果，作為有效的增鋅途徑，受到全球該領域的關注[8]，但該途徑面臨的限制因素包括：育種周期較長，應用成本較高等。因此，施用鋅肥進行作物生物強化以達到增鋅的效果，被認為是安全、高效和可行的措施[10]。Cakmak等[7-8]報道了在田間條件下葉面或土施結合噴施鋅肥，是非常有效和實用的方法，最大限度地提高了小麥籽粒中鋅的吸收和累積，籽粒鋅含量達到60 mg·kg-1。可見，施鋅能夠有效解決作物鋅缺乏帶來的問題，也是植物育種策略的補充方法。

相關研究都已證明，土壤和葉面施用鋅肥可以有效改善缺鋅及潛在缺鋅地區小麥籽粒鋅含量[11-14]。楊月娥等[15]分別在小麥拔節中期和末期（抽穗前）噴施鋅（0.4%ZnSO4·7H2O 750 kg·hm-2），氮、磷、鉀肥的施用均采用當地最佳施肥量和施肥方式，結果表明：土壤pH＜7的區域籽粒鋅含量顯著高于pH＞7的區域，均值分別為 37.0 mg·kg-1和31.8 mg·kg-1。本課題組[14]在黃土高原潛在缺鋅地區對拔節期和灌漿期冬小麥進行噴施硫酸鋅（ZnSO4·7H2O 4.2 kg·hm-2）處理，結果表明籽粒鋅含量達到29.5 mg·kg-1，相比對照增鋅幅度達到25%，仍低于推薦的目標鋅含量。因此，采用傳統鋅肥在該地區進行小麥增鋅調控已經遇到瓶頸。與此同時，ZnO NPs作為工業生產和消費總量達到前列的納米材料，最終通過沉降、遷移而導致對農業生產的影響受到越來越多的重視[16]。大量納米肥料的農業應用研究被報道。有研究表明，納米肥料可以被植物的葉和根吸收[17-18]，但不確定是否以顆粒形態被吸收[19-20]。Zhao等[21]通過電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）測定發現，納米氧化鈰和納米氧化鋅（ZnO NPs）在黃瓜果實中以顆粒形態存在，證實納米粒子可以在生物體內累積。Du等[22]在大田試驗中研究了土施ZnO NPs對小麥生長的影響，在小麥新生根中未發現ZnO NPs粒子，但是SZnO處理與CK相比，小麥組織中的鋅含量增加，這表明ZnO NPs溶解，使Zn2+進入細胞和組織。本課題組[14]設置了僅噴施ZnO NPs和僅噴施硫酸鋅處理的田間微區試驗，研究了兩種處理對于小麥籽粒鋅含量的影響及鋅元素在小麥籽粒中的分布和存在形態，確定ZnO NPs處理較之硫酸鋅處理更好地增加籽粒鋅含量，且ZnO NPs處理籽粒中70%的鋅元素是以磷酸鋅的形式存在于籽粒的折痕組織和糊粉層處，未發現ZnO NPs顆粒。王振紅等[23]發現ZnO NPs較Zn2+更有利于綠豆芽可食部分鋅的富集，使綠豆芽產生更多的過氧化物酶（對高等植物而言，環境脅迫時會形成大量的自由基，植物通過抗氧化系統產生一系列產物來消除過量的自由基），更好地消除體內過量的自由基，并促進自身的生長。但是由于Zn2+植物毒性大于ZnO NPs導致ZnO NPs處理綠豆芽蛋白質含量低于Zn2+。一系列研究[24]表明，納米肥料在農業領域的應用越來越廣泛，在食品生產中發揮關鍵作用。分析原因，是因為納米粒子相對于常規顆粒具有粒徑小、比表面積大和更高反應活性[25]等優勢。因此，結合ZnO NPs不同于傳統鋅肥的特殊性質及其在黃土高原潛在缺鋅區的增鋅潛力，探究其不同的施用方式對冬小麥籽粒增鋅效果的研究值得關注和期待。

綜上所述，以ZnO NPs作為新型肥料，研究不同施用方式對冬小麥籽粒品質及其不同器官之間轉運效率的影響，探索在黃土高原潛在缺鋅區采用ZnO NPs進行增鋅的最佳方式和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗中ZnO NPs（粒徑20 nm±5 nm，純度＞99.6%），購自宏升材料科技有限公司，硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）購自克拉瑪爾（中國）公司。圖1表明，ZnO NPs顆粒呈球形，粒徑約20 nm。飽和溶液的溶解度為7.38 mg·L-1，水溶液中會產生團聚效應，形成較大尺寸的團聚體。

1.2 試驗基地概況

試驗于2015—2016年和2016—2017年連續兩個冬小麥種植季節在陜西省永壽縣御駕宮鎮御中村試驗基地進行，年降水量610 mm，無霜期為210 d，平均氣溫為10.2℃。表1為試驗田土壤的基本理化性質。

圖1 去離子水中ZnO NPs顆粒TEM掃描圖（A）和水動力學尺寸圖（B）Figure 1 TEM scan（A）and hydrodynamic dimension（B）of ZnO NPs particles in DI water

表1 試驗田土壤基本理化性質Table 1 Basic physical and chemical properties of experimental field

1.3 試驗設計

本試驗采用田間微區試驗，共設置：（1）不施鋅對照（CK），（2）噴施硫酸鋅（FZn），（3）土施 ZnO NPs（SZnO），（4）噴施 ZnO NPs（FZnO），（5）土噴結合ZnO NPs（SFZnO），共計5個處理。其中，SZnO處理用量為102.3 kg·hm-2，在播種前拌土施入土壤。FZnO處理用量為1.2 kg·hm-2。SFZnO為SZnO與FZnO的總和，其中ZnO NPs施肥用量參考文獻[22]。FZn處理用量為施 ZnSO4·7H2O 4.2 kg·hm-2，為地區最佳用量。在小麥拔節期和抽穗后期各噴施一次，噴施量均為600 L·hm-2。所有處理在播前均施用120 kg N·hm-2的氮肥和90 kg P2O5·hm-2的磷肥，肥料分別為尿素和磷酸二銨。試驗小區的面積為9 m（23 m×3 m），小麥品種為洛旱6號，播種量為150 kg·hm-2，株行距20 cm，每個處理采用完全隨機區組設計，設置4個重復。

1.4 樣品采集及測定方法

小麥成熟期，在每個小區內部隨機收獲兩個1 m2樣方的籽粒，烘干后測定籽粒產量和生物量。在每個小區隨機選取3個1 m長樣段，將小麥連根拔起后進行組織分離。組織器官分為莖、葉、穗（籽粒、穎殼）三部分，風干后稱量記錄數據，穗風干后脫粒，稱量風干籽粒和穎殼并記錄。稱取一部分有代表性的莖、葉、穎殼、籽粒樣品，分別測定其含水量并記錄數據。在風干樣中取有代表性的樣品用蒸餾水清洗3次，在烘箱中烘干48 h以上。然后使用碳化鎢球磨儀（萊馳MM 400，德國）磨碎，干燥密封保存。磨碎樣品和標準面粉采用濃HNO3-H2O2微波消解（屹堯WX-8000，中國），標準面粉GBW10046（GSB-24）用于質量控制，平均回收率為93%。利用石墨爐原子吸收分光光度法（日立Z2000，日本）測定其微量元素含量。使用近紅外分析儀測定小麥籽粒品質指標。使用掃描電子顯微鏡（SEM，日立S-4800，日本）觀測拔節期小麥葉片的微觀結構。利用透射電子顯微鏡（TEM，JEOL 100CX，日本）觀測ZnO NPs顆粒微觀結構。使用馬爾文激光粒度儀（Mastersizer2000，英國）測定ZnONPs顆粒水動力學尺寸。

1.5 數據處理

實驗數據處理采用SPSS 19.0進行統計分析，采用LSD法進行多重比較，顯著性差異為P＜0.05。

2 結果與討論

2.1 ZnO NPs的不同施用方式對冬小麥產量構成因素及其籽粒品質的影響

鋅是小麥機體酶的組成和蛋白質合成不可或缺的部分。生長過程中鋅的主要來源是土壤有效鋅，當土壤缺鋅時，會抑制小麥正常生長。在本研究中，表2數據表明第一年的產量平均為7593 kg·hm-2，第二年產量平均為5541 kg·hm-2，兩年之間的差異主要是由于第二年雨水嚴重不足，造成小麥減產。第一年的收獲指數達到51%左右，第二年為40%左右，說明環境的變化對小麥的產品質量也產生了明顯影響。在同一年的不同處理中，施用鋅肥對小麥產量沒有較顯著的影響，說明本地區施用鋅肥沒有增加小麥產量。與前人報道結果基本一致。例如，李孟華等[26]研究表明：在潛在缺鋅地區土施50 kg·hm-2和噴施4.8 kg·hm-2硫酸鋅的處理對產量無顯著影響。根據韓金玲等[27]的結果表明：旱地施用鋅肥使小麥干物質累積量顯著增多，但施鋅肥過量，干物質累積量減少，各產量構成因素受鋅影響較小，差異均未達顯著水平。Du等[22]開展的土施ZnO NPs對小麥生長的微區試驗表明，在農田土壤施用ZnO NPs不會造成生物量的差異。

在本研究中，兩年的小麥籽粒的品質指標（谷蛋白、可溶性糖和淀粉）結果（表3）表明：各處理間無顯著差異，淀粉、可溶性糖和谷蛋白含量沒有因為產量變化產生差異，表明產量的變化對籽粒品質沒有產生直接影響。張潔梅[28]對黃淮平原區冬小麥揚花期和灌漿中期進行了噴施硫酸鋅處理研究，結果表明：小麥籽粒可溶性糖含量提高0.21～2.98 mg·g-1，達到顯著水平。張曉等[13]的研究表明施用鋅肥能明顯提高籽粒中相應的微量元素含量，但對籽粒蛋白質含量影響均不顯著。說明不同的地區、不同的施用方式及時間因素都可能對小麥籽粒品質因素構成影響，與本研究結果一致。ZnO NPs和硫酸鋅的處理對籽粒品質指標的影響沒有差異，表明ZnO NPs對小麥籽粒品質沒有產生不良影響，證實了ZnO NPs在大田施用的可行性和安全性。

2.2 ZnO NPs的不同施用方式對冬小麥籽粒鋅含量及累積量的影響

ZnO NPs不同施用方式對冬小麥籽粒鋅含量及累積量有顯著影響，兩年度不同處理對籽粒鋅含量的影響一致。表4的數據表明，第一年度里，FZn、SZnO、FZnO和SFZnO處理中小麥籽粒鋅含量比CK分別提高了10%、30%、50%和60%；第二年度里，FZn、SZnO、FZnO和SFZnO處理中小麥籽粒鋅含量比CK分別提高了27%、40%、43%和58%。兩年試驗期間，不同處理對小麥籽粒增鋅效果從大到小依次為：SFZnO＞FZnO＞SZnO＞FZn。雖然各處理均具有一定的小麥籽粒增鋅效果，但仍以SFZnO處理效果最為顯著，是因為土噴結合兼具了土施和噴施的增鋅效果。SFZnO處理籽粒最高鋅含量分別為：30.2 mg·kg-1和36.9 mg·kg-1，兩年間鋅含量存在差異，可能的原因是氣候因素對大田試驗影響較大，造成年際之間的產量形成較大差異。而籽粒中微量元素含量與產量之間具有稀釋濃縮效應，從而造成鋅含量之間的差異。因此，年際之間鋅含量的對比不能體現鋅肥的差異。FZnO處理和FZn處理的籽粒鋅含量對比，在第一年FZnO比FZn高36%，第二年高12%。兩年間提高幅度受產量影響，但是ZnO NPs處理的籽粒鋅含量顯著高于硫酸鋅處理。說明噴施相同量的不同鋅肥，小麥籽粒對ZnO NPs的吸收效率顯著高于硫酸鋅[29]。原因是ZnO NPs通過葉片組織進入植物體，同時較強的吸附性使得ZnO NPs長期吸附在葉片上作為鋅庫供鋅。研究表明，納米粒子的高效轉移、吸收與納米粒子的濃度、粒徑、表面積、理化性質、表面涂敷和稀釋劑有關[30]。因為植物細胞被半透性細胞壁包裹，細胞壁孔徑約為2～20 nm，噴施在小麥葉片上較小的納米粒子可以直接穿過細胞壁，被葉片細胞吸收[31]。也有研究發現，納米顆粒可以刺激植物細胞壁形成更大的孔隙，使得更多的納米粒子進入細胞[22]。

表2 ZnO NPs的不同施用方式對冬小麥產量、生物量和收獲指數的影響Table 2 Effects of different application methods of ZnO NPs on yield，biomass，and harvest index of winter wheat

表3 ZnO NPs的不同施用方式對冬小麥籽粒品質的影響Table 3 Effect of different application methods of ZnO NPs on grain quality of winter wheat

本研究中，第一年FZnO處理籽粒鋅含量比SZnO處理高15%，SFZnO比FZnO高6%，說明小麥籽粒中增加的鋅主要來自于FZnO。分析原因為土施鋅肥在土壤環境中經過一系列反應，由植物根部吸收后，經地上部器官運輸到籽粒中，吸收轉運效率低。而噴施鋅肥可直接由葉片吸收運輸到籽粒中，效率較高。土施作為一種傳統的施肥手段，其用量大，效率低的短板無法彌補。而噴施具有用量少、效率高、環境負荷小等優勢。所以FZnO與SZnO相比，噴施是一種更為高效的增鋅方式。噴施的ZnO NPs不僅有快速吸收的特性，還可以緩慢釋放[32]。Du等[22]土施ZnO NPs，使得小麥組織中的鋅含量增加，這表明ZnO NPs溶解，使Zn2+進入細胞和組織，這與本研究SZnO處理的結果一致。Torabian等[33]研究表明葉面噴施ZnO NPs可極大提高向陽植物（向日葵）中的鋅含量，Zhang等[14]研究葉面噴施ZnO NPs使得小麥籽粒鋅含量顯著提高，通過X射線近邊結構譜（XANES）的分析發現，70%～80%的鋅以磷鋅化合物的形式存在于籽粒中，與本研究噴施ZnO NPs顯著增鋅結果一致。

表4 ZnO NPs的不同施用方式對冬小麥籽粒鋅含量及累積量的影響Table 4 Effects of different application methods of ZnO NPs on grain Zn content and accumulation of winter wheat

籽粒鋅累積量在兩年度各處理中的含量順序一致，但差異不同。第一年籽粒鋅累積量在FZn與CK之間和SFZnO與FZnO之間差異不顯著，但SFZnO和FZnO與其他處理差異顯著。FZn、SZnO、FZnO和SFZnO處理相比CK分別提高了8%、25%、44%和54%。籽粒鋅累積量在第二年度中各處理間的趨勢與第一年類似，相比CK均有顯著差異，FZn、SZnO、FZnO和SFZnO相比CK分別提高了19%、34%、37%和62%。研究結果與齊義濤等[34]葉面噴施硫酸鋅對小麥籽粒各部位鋅累積量的影響結果一致。曹玉賢等[11]和趙愛青[35]研究均表明，潛在缺鋅的石灰性土壤上，土施鋅肥處理對小麥籽粒的增鋅效應顯著低于噴施處理。土施鋅肥雖可大幅度提高耕層土壤有效鋅含量，但對籽粒鋅含量提升的影響較小。這與本研究中，噴施鋅肥處理的小麥籽粒鋅含量和鋅累積量較高的結果一致。

2.3 ZnO NPs的不同施用方式對冬小麥根、莖葉和穎殼鋅含量及累積量的影響

表5表明，在第一年中，根的鋅含量FZn、SZnO、FZnO和SFZnO對比CK分別高出8%、60%、8%和114%；莖葉鋅含量分別高出94%、123%、1102%和1423%；穎殼各處理分別高出65%、58%、413%和455%。第二年中，根的鋅含量FZn、SZnO、FZnO和SFZnO對比CK分別高出45%、135%、5%和190%；莖葉分別高出570%、387%、1853%、2088%；穎殼分別高出25%、53%、175%和180%。鋅在根、莖葉和穎殼中的累積量趨勢和鋅含量趨于一致，均表現出含鋅量（鋅含量或鋅累積量）隨著鋅肥的施用而顯著增加。小麥根的數據表明，無論噴施哪種鋅肥，均不能較好地增加根中的鋅含量，是因為噴施處理在地上部進行，吸收轉移到地下效率極低。反觀土施鋅肥，ZnO NPs較FZn和CK都形成顯著差異。FZnO和SFZnO處理與FZn處理地上部器官含鋅量形成顯著差異，但SZnO與FZn未形成顯著差異，是因為土施容易造成鋅肥鈍化無法被作物吸收，而FZn低于FZnO則是因為吸附力差易受環境影響造成流失。說明土施可以取得一定的增鋅效果，但遠低于土噴結合和噴施處理的增鋅效果，也說明各器官增加的鋅主要來自FZnO。

與CK相比，各處理均增加了小麥根、莖葉和穎殼鋅累積量，在地上部器官中FZnO和SFZnO處理增加的幅度最高，莖葉的鋅累積量達到數十倍的增幅。但在地下部的根中，鋅累積量較之地上部器官取得了較小的增幅。分析原因可能是因為土壤環境較為復雜，對植物吸收利用鋅肥產生影響，降低了根對鋅肥的吸收效率。同時又因為葉面噴施ZnO NPs會導致較多的顆粒黏附在葉面上，從而極大地提高莖葉的含鋅量，導致噴施和土噴結合處理的莖葉含鋅量顯著提高。陸欣春等[36]的研究表明，在石灰性土壤中氮鋅肥配施可增加小麥各部分的鋅累積量。本試驗在當地最佳施氮水平下，實現地上部器官鋅累積量顯著增加與其研究結果一致。FZnO和SFZnO取得最顯著效果，大幅度提高了莖葉和穎殼的鋅含量和累積量。同時莖葉和穎殼上較高的鋅含量也為更多的鋅進入到植物體內創造了可能。

2.4 施用ZnO NPs對小麥葉片表面結構的影響及尺寸關系

圖2A為CK的氣孔，張永平等[37]的研究表明，小麥葉片的氣孔長約45±1 μm，寬約25±1 μm，這與圖2A顯示的結果一致。使用能譜儀對拔節期FZn和FZnO處理的葉尖進行元素掃描，通過圖2C、圖2D可以明顯地看出，FZnO一周后有少量附著，含量與FZn形成顯著差異。

通過圖2A可以確定，ZnO NPs粒子（＜100 nm）遠小于小麥氣孔的孔徑（45 μm×25 μm）[37]，觀測結果表明：就尺寸對比而言，ZnO NPs粒子作為自由態鋅離子完全可以通過氣孔進入到小麥葉片。汪洪等[38]的研究表明鋅在植物中存在的形式常為自由態離子、低分子量有機物配合態復合物、貯存金屬蛋白以及與細胞壁結合的非溶形式，自由態鋅離子的濃度一般較低，植物體中鋅的運輸需要通過載體蛋白進行跨膜運輸。也有研究[20]表明納米粒子可以刺激植物葉片氣孔細胞產生變化，通過胞吞形式吸收納米顆粒。圖2B為拔節期噴施ZnO NPs處理后一周的小麥葉片氣孔圖。圖中可清晰看到白色附著物，能譜儀掃描結果顯示（圖2C）：白色十字處鋅含量顯著高于硫酸鋅處理（圖2D）同樣位置的鋅含量。FZn處理的葉片氣孔掃描圖未發現附著物和較顯著的結構變化，和CK氣孔圖無差異。但是目前在小麥大田試驗中還沒有相關報道證明ZnO NPs進入到小麥體內，對于ZnO NPs是否可以進入小麥體內和如何進入還需要進一步的測定，從而明確ZnO NPs的進入途徑和機理，為確定納米粒子對生物安全的影響提供理論依據。

3 結論

（1）在本試驗中，施用ZnO NPs處理的小麥籽粒鋅含量相比CK增量達到60%，較硫酸鋅處理也有顯著提高，對于小麥產量和籽粒品質沒有影響。證明ZnO NPs可以作為一種新型肥料應用于農業研究。

（2）比較不同施用方式發現，FZnO比SZnO更容易被植物吸收利用。在籽粒和其他器官中，無論什么方式施用ZnO NPs，都可以被植物體吸收轉運，但是噴施比土施更容易被植物吸收利用。

（3）通過觀察葉片微觀結構，證實ZnO NPs顆粒粒徑遠小于葉片氣孔孔徑，發現ZnO NPs顆?？梢愿街谛←溔~片上，經過葉片的轉化利用可以被植物葉片吸收。

表5 ZnO NPs的不同施用方式對冬小麥根、莖葉和穎殼鋅含量及累積量的影響Table 5 Effects of different application methods of ZnO NPs on Zn content and accumulation in roots，stems，and glume of winter wheat

圖2 施用ZnO NPs對小麥葉片結構的影響及尺寸關系Figure 2 Effect of ZnO NPs on wheat leaf structure and size relationship