轉基因玉米ZZM030對大型蚤（Daphnia magna）生長和繁殖的影響

張 莉，沈文靜，方志翔，劉 標

（生態環境部南京環境科學研究所,南京 210042）

玉米害蟲和田間雜草是影響玉米產量的重要因素，因此，增強玉米對害蟲和雜草的抵抗力一直是玉米品種改良的重要內容[1]，利用轉基因技術將外源抗蟲基因和耐除草劑基因同時轉入玉米基因組中，培育出抗蟲/耐除草劑雙抗轉基因玉米新品種，這一技術的成功應用不僅顯著降低蟲害和草害對玉米產量的影響，增加農民收入，而且還避免了大量使用化學農藥帶來的環境污染、害蟲產生抗藥性等各種弊端，在農業生產上具有重要意義。

與傳統育種技術不同，轉基因技術在創造優良種質資源和培育植物新品種的同時，轉基因作物對環境和人類健康可能存在的風險也不能忽視[2]。轉基因作物培育過程中，外源基因的隨機插入，可能會影響轉基因作物本身內源基因的表達，進而產生非預期效應，如改變作物中的營養元素、抗營養因子或固有植物毒素的表達水平等[3-5]，如果轉基因作物發生了這些改變，可能會對一些生物的健康產生潛在影響。現有的轉基因作物及產品安全性評價研究，實驗動物主要為大型禽畜[6-8]、小型嚙齒動物[9-11]，對水生生物的研究以某些魚類為主[12-15]，而對于可直接或間接接觸到轉基因作物及其產品的小型水生動物的研究主要集中于毛翅目石蛾幼蟲[16-18]以及雙翅目蚊子幼蟲[18]。

轉基因作物種植區及周邊溝渠、池塘等自然水域，是許多無脊椎浮游動物的棲息地，轉基因作物在栽培和生長過程中，其碎屑物、花粉等可能會借助風力、水流、動物攜帶等方式進入周邊水體，從而使周邊水體中的水生生物接觸到轉基因成分。由于轉基因作物及相關成分進入水體是一種有機物質的輸入，可能會對無脊椎動物群落結構、數量以及攝食行為等產生影響[19]，因此評價轉基因作物對環境中某些代表性水生無脊椎物種的潛在毒性效應，對農田及周邊水生生態系統生物多樣性保護具有重要意義。大型蚤（Daphnia magna）為浮游動物的重要類群，是水中細菌、單細胞藻類、有機物碎屑的主要消費者，也是魚類等水生生物的天然餌料。由于大型蚤對5～50 μm粒徑的食物沒有自主選擇性[20-22]，其在濾食過程中，可能會取食到含有轉基因成分的碎屑物[22]；另外，大型蚤作為水生模式動物，生活周期短、室內培養簡易、對污染物反應靈敏[23-24]，已具備成熟的環境物質監測評價方法，因此本研究以大型蚤為研究對象，運用亞慢性毒理學原理，在實驗室條件下模擬轉基因玉米ZZM030對水生代表性物種的影響，以期為轉基因玉米的生態環境安全提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所使用的抗蟲耐除草劑轉基因玉米ZZM030（ZZM030）為中國種子集團有限公司自主研發品系，是以親本對照玉米祥249（X249）為受體材料，插入外源cry1Ab/c基因以及epsps基因，同時具有抗蟲特性和對草甘膦和草丁膦除草劑的抗性。

將ZZM030籽粒和X249籽粒剔除霉變粒、秸稈等雜物后，使用TGQ20流化床超音速氣流粉碎分級機低溫（＜10℃）粉碎至粒徑＜10 μm，粉碎后的玉米粉-80℃儲存備用，使用時用大型蚤水生四號培養液[25]配制成1.5 g·L-1的米粉液。為避免樣品間的交叉污染，首先對親本玉米進行籽粒粉碎。

1.2 試驗動物

試驗動物大型蚤（Daphnia magna）為本實驗室培養3代以上、具有相同遺傳背景的孤雌生殖幼蚤，蚤齡小于24 h。試驗蚤在測試前，依據大型蚤毒性試驗敏感性要求，測定20℃時重鉻酸鉀（Sigma，美國）24 h半數效應濃度（24 h-EC50）。測定結果顯示，重鉻酸鉀24 h-EC50為1.127 mg·L-1，符合實驗要求[26]。

1.3 試驗方法

試驗分小球藻（Chlorella vulgaris）組、X249玉米粉組和ZZM030玉米粉組3個處理，每處理3個重復，每個重復10只大型蚤。實驗容器為50 mL燒杯，并盛放40 mL大型蚤培養液[25]，每個燒杯隨機放置1只蚤。試驗過程中，各處理組大型蚤每日飼喂1次，其中小球藻組飼喂濃縮后的小球藻藻液，密度約為5×105個·mL-1，X249玉米粉組和ZZM030玉米粉組分別飼喂濃度為1.5 g·L-1的玉米粉1 mL，本研究實驗設計參照了文獻[22，27]的方法。實驗過程中，每日定時觀察和記錄各處理組大型蚤存活和繁殖情況，大型蚤開始繁殖后，記錄各處理組蚤繁殖情況，并將新生幼蚤移出。實驗過程中，每隔2 d更新1次培養液。試驗初始、第7、14、21 d和第28 d時，使用顯微鏡（LEICAM125）測定大型蚤體長。試驗在培養箱（Binder-KBF720，德國）中進行，溫度（22±1）℃，光暗比16 h∶8 h，光強60 μmol·m-2s-1，共持續28 d。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2003統計分析軟件進行數據錄入和整理，用IBM SPSS 17.0軟件ANOVA程序中的單因素方差分析及Tukey′s test多重比較進行數據顯著性差異分析，以P=0.05作為統計學上檢驗的顯著性水準。

2 結果與分析

2.1 存活率

圖1顯示的是飼喂小球藻、親本玉米X249和抗蟲耐除草劑玉米ZZM030的實驗蚤28 d存活率變化情況。如圖1所示，小球藻組大型蚤在測試期內存活率緩慢下降，雖然個別試驗蚤在幼齡期及成齡早期（＜7 d）存在死亡現象，但7 d后實驗蚤存活率緩慢下降，至28 d試驗結束時，小球藻組存活率達46%。與對照小球藻組相比，飼喂X249和ZZM030玉米粉均使大型蚤死亡率增加，在試驗期內，兩個玉米粉組試驗蚤隨實驗天數的增加均有一定的死亡，方差分析顯示ZZM030組大型蚤和親本X249組大型蚤存活率沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同處理組大型蚤存活率變化Figure 1 Survival rate of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris，X249 maize and ZZM030 transgenic maize

2.2 體長

研究測定了不同食物飼喂條件下試驗蚤初始、第7、14、21 d及第28 d體長。研究發現，不同食物飼喂條件下大型蚤的體長不同（圖2）。小球藻組試驗蚤體長在試驗初期增長較快，14 d后，體長緩慢增長。而兩個玉米粉組試驗蚤體長試驗期內呈現緩慢增長趨勢，從試驗初始至第28 d，飼喂抗蟲耐除草劑玉米ZZM030的大型蚤體長與親本X249組試驗蚤體長相當，兩者之間沒有顯著差異。至28 d實驗結束時，小球藻組、X249組和ZZM030組大型蚤平均體長分別為（3.82±0.25）mm、（2.54±0.14）mm和（2.64±0.22）mm，兩個玉米粉組實驗蚤最終體長與小球藻組實驗蚤最終體長達到顯著差異水平（P＜0.05），但X249和ZZM030玉米粉組大型蚤間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 繁殖

不同飼喂處理條件下大型蚤的繁殖參數見表1。飼喂親本玉米X249和抗蟲耐除草劑玉米ZZM030的大型蚤在首次抱卵時間、首次產幼蚤時間、新生幼蚤總數上與小球藻組實驗蚤均有顯著差異（P＜0.05）。對于X249組和ZZM030組大型蚤，統計分析表明，抗蟲耐除草劑玉米ZZM030和親本玉米X249組大型蚤在上述參數上均無顯著性差異（P＞0.05），28 d試驗期內，各處理組試驗蚤均未出現卵鞍。

3 討論

地上水域和鄰近陸地環境密切相關[28]，轉基因作物在生長過程中，風力可使作物花粉漂移到110 m遠的地方[29]，雨水也可以使花粉脫落并隨水流轉運，作物收獲后，滯留在農田內的作物殘體可被風或水流運送到周圍水體，這些轉基因作物副產品一旦進入水域，可能會被微生物分解、水生動物消耗、沉積或漂流至下游水域，并成為農業灌溉水渠中碎屑物的組分之一[16]。轉基因作物開發和應用過程中，含有外源蛋白的作物碎屑物進入水體后，是否會對食碎屑類生物產生不利影響？基于轉基因作物對水生生物可能存有生態安全風險，本研究以抗蟲耐除草劑轉基因玉米ZZM030及其親本非轉基因玉米祥249為研究材料，以水生生物大型蚤為研究對象，使大型蚤的食物來源全部為轉基因玉米碎屑物，室內可控條件下研究轉基因作物材料對特定非靶標水生生物的影響。

圖2 不同處理組大型蚤的體長變化Figure 2 Body size of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris，X249 maize and ZZM030 transgenic maize

表1 不同處理組大型蚤繁殖參數Table 1 Fecundity of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris，X249 maize and ZZM030 transgenic maize

在28 d測試期內，以抗蟲耐除草劑玉米ZZM030飼喂大型蚤，通過大型蚤存活率、體長、首次抱卵時間、首次產幼蚤時間和新生幼蚤總數等參數，評價ZZM030對大型蚤的安全性。實驗結果表明，與飼喂X249親本玉米粉的大型蚤相比，ZZM030玉米粉組大型蚤的生長指標存活率和體長，以及首次抱卵時間等繁殖指標（表1）與親本玉米沒有顯著差異，實驗期間未出現有性生殖的卵鞍，這些結果說明ZZM030轉基因玉米并沒有對大型蚤產生不良影響。Mendelson等[30]使用 100 mg·L-1和 150 mg·L-1的轉cry1Ab花粉和100 mg·L-1轉cry1F基因玉米花粉飼喂大型蚤48 h，測試期間大型蚤沒有出現不良反應。張莉等[27]使用轉cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5飼喂大型蚤28 d也得到了相似的結論。與我們的研究結果不同的是，B?hn 等[22，31]使用轉 cry1Ab基因玉米飼喂大型蚤 42 d，發現與對照組相比Bt玉米組的大型蚤適合度下降，使用轉基因玉米飼喂的大型蚤死亡率增加、實驗蚤性成熟時間延長、新生幼蚤總數下降，其他一些轉基因作物對大型蚤的室內評價研究也有相似結論[32-33]?，F有以大型蚤為試驗動物進行轉基因作物的安全性評價研究，通常采用不同的評價時間、不同的劑量水平和評價參數來達到評價目的，而轉基因作物的品種、飼喂劑量、暴露時間等參數的不同[34]，都可能會對大型蚤受試物毒性評價的結果產生影響，上述結果的不一致性可能與下列因素有關：（1）轉基因作物品種差異。上述研究者使用的轉基因玉米材料在目標基因上明顯不同，受體材料和轉育過程也不盡相同，這些遺傳背景上的差異可能產生的非預期效應的類型和程度，以及不同材料組成成分上的差異都會在一定程度上影響大型蚤評價結果；（2）暴露時間不同。大型蚤在受試物中的暴露時間不同，對大型蚤產生的影響也會不同[25]。研究者用大型蚤進行飼喂試驗時，暴露時間在48 h～42 d不等，本研究采用28 d，0～28 d這一時間段涵蓋了大型蚤幼齡期及成齡期，此時大型蚤生長和繁殖已經趨于穩定[35]，能夠得出穩定可靠的評價結果。而B?hn等[22，31]選用42 d，暴露時間的延長雖然可能將一些不良效應或微小變化所產生的影響表現出來，但此時大型蚤已趨于衰老，衰老過程中抗氧化防御體系的損壞以及抗逆性變化等不可控因素可能會干擾評價結果[36-37]。

目前轉基因作物對大型蚤生態安全性評價研究中，研究者多參照經典毒理學評價方法，與化學品組分明確和結構明晰不同，轉基因作物在營養成分、潛在致敏性、代謝產物等方面可能存在一些不確定因素，這在一定程度上突出了轉基因作物安全性評價的復雜性，因此評價過程中，盡可能使實驗條件標準規范化、選擇合理的響應參數，這將有助于得到可靠的實驗數據和評價結果。在使用轉基因作物對大型蚤進行生態安全性評價研究中，研究者多以作物種子或果實、花粉、葉片等作為測試材料，這些材料以微粒形式進入大型蚤培養液時，若飼喂劑量較低，則不能滿足大型蚤的生存需求；若飼喂劑量過高，富余的受試材料微粒懸浮在培養液中，這部分受試物微粒容易黏附于大型蚤的觸角、殼刺等部位，使大型蚤浮游能力下降，還易引起培養液水質惡化，進而間接增加培養液的更新頻率，由此也可能增加大型蚤機械性損傷。因此，使用不同轉基因作物材料進行研究時，盡可能選擇合理的受試材料濃度，并加強培養液水體環境變化檢測，這將有助于降低環境條件引起的可能誤差。另外，本研究在評估轉基因玉米ZZM030對大型蚤生長和繁殖的影響評價時，優先選擇大型蚤存活率、體長、新生幼蚤總數3個最常用的監測指標，而其他一些可以量化的指標，如受試蚤首次繁殖時間、首次新生幼蚤數、產幼蚤次數、試驗期間是否有卵鞍出現等指標能夠提供一些亞毒性效應信息，這些參數作為輔助檢測指標能夠更好地說明轉基因玉米ZZM030是否對大型蚤產生某些不利影響。

4 結論

本研究以抗蟲耐除草劑轉基因玉米ZZM030（ZZM030）及其親本非轉基因玉米祥249（X249）為研究材料，以ZZM030和X249玉米粉為食物來源對大型蚤進行28 d飼喂實驗，未發現轉基因玉米材料ZZM030對大型蚤生長和繁殖產生不良影響，28 d飼喂結果表明抗蟲耐除草劑玉米ZZM030與X249親本玉米對大型蚤具有同樣的安全性。