傳統發酵肉制品中降解生物胺菌株的篩選鑒定與應用研究

牛天嬌，陳歷水，孔杭如，郭永杰，馬 鶯

（1.哈爾濱工業大學 化工與化學學院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限公司，北京 101100；3.中糧營養健康研究院，北京 102209）

生物胺是一類含氮的低分子質量活性有機化合物，主要由特殊的生物胺脫羧酶通過轉化特定的氨基酸形成對應的生物胺[1]。適量的生物胺有助于人體正常的生理功能，而過量的生物胺則會導致中毒，引起頭痛、血壓變化、嘔吐等一系列嚴重反應[2]。它是影響發酵肉制品安全性的重要因素之一，目前生產上多采用低溫儲藏、超高壓處理[3-5]和使用食品添加劑[6-7]等方法控制生物胺。這些方法能夠在一定程度上減少產品中的生物胺含量，但不能降解已經產生的生物胺，且可能會抑制微生物的生長，因此不適用于發酵香腸的生產[8]。由此可見，找到有效的生物胺控制方法迫在眉睫。相比之下，利用發酵劑來控制發酵肉制品中的生物胺含量具有非常大的應用潛力，其中能夠產生胺氧化酶的發酵劑因具有可以降解產品中已有的生物胺的優勢而成為近年來的研究熱點。有研究發現使用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）進行發酵時，生物胺的濃度下降了24%[9-10]，并且添加植物乳桿菌的劑量對總生物胺的產量影響更大[7，11]。ERKKILA S等[12]對發酵香腸的研究表明，游離氨基酸的含量是發酵過程中生物胺形成的限制性因素。TOSUKHOWONG A等[13]報道，植物乳桿菌可以顯著降低泰國發酵香腸中尸胺、腐胺、酪胺和組胺的含量。SUN Q X等[14]研究了植物乳桿菌對哈爾濱香腸的影響作用，結果表明植物乳桿菌可對尸胺、腐胺、色胺、2-苯乙胺、組胺和酪胺等生物胺起到抑制作用，且與其他乳桿菌混合后起到更強的抑制效果。CAPOZZI V等[15]研究表明，26株植物乳桿菌可降解葡萄酒發酵過程中產生的生物胺，其可作為乳酸發酵劑。ZHANG Q L等[16]探討了植物乳桿菌ZY-40對鰱魚香腸發酵過程中生物胺的降解作用，研究發現植物乳桿菌ZY-40可降低70%以上的腐胺和尸胺，且可增加游離氨基酸的含量。

本研究對65株來源于傳統發酵肉制品的耐鹽、耐亞硝酸鹽的乳酸菌，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進行產生物胺定性定量檢測，篩選出降解率最高的不產生物胺菌株。經形態學特征、生理生化特性研究，并結合16S rDNA序列分析對其進行鑒定，同時探索其作為發酵劑對發酵香腸中生物胺含量的影響作用，從而為發酵肉制品發酵劑的篩選、生產質量安全控制、營養功能提升提供理論依據。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

臘腸：分別購于成都、長沙、北京和昆明菜市場；發酵肉用發酵劑、商業用木糖葡糖球菌（Staphylococcus xylosus）：科漢森（北京）貿易有限公司；豬肉：市售。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，葡萄糖20.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，檸檬酸氫二銨2.0g/L，無水乙酸鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，吐溫80 0.1%，MgSO·47H2O 0.58 g/L，MnSO·44H2O 0.25 g/L。加熱煮沸溶解，調節pH值到6.8，121℃高壓滅菌15 min。

MRS固體培養基：在MRS液體培養基的基礎上添加1.5%瓊脂，121℃高壓滅菌15 min。

營養肉湯培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，調節pH值至7.4，121℃高壓滅菌15 min。

甘油培養基：脫脂乳12.0 g，水90 mL，甘油30 mL（約36 g），121 ℃滅菌15 min。

雙層顯色上層培養基：溴甲酚紫0.06 g，瓊脂20.0 g，1 000 mL蒸餾水，pH 5.2。121℃滅菌10 min。

雙層顯色下層培養基：蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，牛肉膏5.0g，NaCl2.5g，葡萄糖 0.5g，吐溫801mL，MgSO40.4 g，MnSO40.03 g，K2HPO42.0 g，檸檬酸三銨 2.0 g，CaCO30.1 g，FeSO40.04 g，VB10.01 g，磷酸吡哆醛0.05 g，瓊脂18.0 g。色氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸各5.0 g，1 000 mL蒸餾水，pH 5.2。115℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏（均為生化試劑）：北京陸橋技術股份有限公司；色胺、酪胺、腐胺、苯乙胺、尸胺、組胺、精胺、亞精胺、乙腈、丹磺酰氯（dansyl chloride，DNS-Cl）（均為色譜純）：美國Sigma公司；磷酸氫二鉀、MnSO·44H2O、NaCl、NaOH、NaNO2、高氯酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；KOD-Plus高保真脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：日本Toyobo公司；DNA凝膠回收試劑盒：北京博大泰克生物技術有限責任公司；PMD 19-T Vector Cloning試劑盒、Taq酶（5 U/μL）及Buffer：寶生物工程（大連）有限公司；生化鑒定用反應管：杭州天和生物有限公司；API 20 E腸桿菌試劑條：法國梅里埃公司。

1.2 儀器與設備

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：日本TaKaRa公司；Lambda 25 UV/VIS spectrometer型分光光度計：美國Perkin Elmer公司；3K30型低溫高速離心機：德國Satorious公司；SPX-250-C恒溫培養箱：上?，槴\實驗設備有限公司；微孔過濾膜（0.22 μm）：濟南賽暢科學儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵肉中細菌的分離和不產生物胺菌株的篩選

稱取4種市售發酵肉制品產品樣品各10 g，分別加入90 mL無菌生理鹽水，4℃渦旋振蕩（200 r/min）1 min，離心、取上清備用。選擇3個合適的梯度10-5、10-6、10-7，取10-7稀釋溶液通過稀釋倒平板法分別接種于含有6%NaCl、100 mg/kg NaNO2的MRS固體培養基上，37℃倒置培養24 h。挑取不同菌落形態、大小、顏色、生長位置的單菌落，以平板劃線反復分離純化，直至得到單菌落，將純化后的單菌落進行培養保藏在甘油培養基中，每個菌株保藏3管，放置于-20℃，備用。將上述得到的菌株取一接種環接種到雙層顯色下層培養基上，37℃靜置培養48 h后，無菌條件下，在下層培養基上倒上一層上層培養基（50℃）顯色，并在5 min內記錄實驗結果，顯紫色的為陽性（產胺菌），不變色即黃色為陰性（不產胺菌），以不接種菌株的培養基作為空白對照。選取陰性菌株作為實驗菌株。

1.3.2 菌株生物胺降解能力評價

（1）菌液制備

將篩選出的不產胺菌株分別以107CFU/g的濃度接入到含50 mg/L 8種生物胺的營養肉湯培養基中，37℃靜置培養48 h后，將菌液與等體積0.4 mol/L高氯酸混合，于-20℃冰箱中保存、待測，以不接種菌株的MRS液體培養基作為空白對照。

（2）柱前衍生

取上述樣品菌液和空白對照各1mL，分別先加入2mol/L NaOH溶液200 μL，再加入300 μL飽和NaHCO3溶液進行緩沖，然后再加入2 mLDNS-Cl溶液（含10 mg/mL丙酮），40℃水浴暗反應45 min，加入100 μL NH3·H2O終止反應，去除殘留的DNS-Cl溶液。用乙腈定容到5 mL，過0.22 μm有機濾膜后裝入棕色液相樣品瓶待測。

（3）生物胺含量測定

準確稱取色胺、酪胺、腐胺、2-苯乙胺、尸胺、組胺、精胺、亞精胺各50mg，分別用0.4mol/L的高氯酸定容至50mL，并稀釋成質量濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的標準溶液。取1 mL標準溶液，柱前衍生后（方法同上），利用高效液相色譜進行測定，以生物胺含量（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制8種生物胺的標準曲線，用標準曲線回歸方程對樣品中生物胺含量進行定量分析。

高效液相色譜條件：AgilentC18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流動相A為超純水，流動相B為乙腈；流速0.9 mL/min；進樣量20 μL；柱溫30℃；檢測波長254 nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 生物胺分析的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution programs for biogenic amines analysis

1.3.3菌株的鑒定

（1）菌株的活化

取一接種環植物乳桿菌PL-ZL001接種于MRS液體培養基中，37℃靜置培養24 h后，進行下一代活化，連續活化3代，備用。

（2）菌株的生理生化和形態學鑒定

對分離得到的菌株進行生理生化鑒定和形態學鑒定，鑒定標準參考《常見細菌鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》。

生長曲線測定：將活化后的菌種接種于MRS液體培養基，37℃培養24 h，每2 h用分光光度計在波長600 nm處測定菌液的吸光度值（OD600nm）值，記錄數據繪制生長曲線。以MRS培養基為空白對照。

pH變化曲線測定：將篩選得到的菌種接種于MRS液體培養基中，37℃靜置培養24 h，每2 h用酸度計測定pH值，記錄數據繪制pH值變化曲線。

（3）菌株的分子生物學鑒定

16SrDNA的分析采用菌落PCR方法進行擴增。16SrDNA序列擴增的引物為：

正向引物為F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；反向引物為R：5'-AAGGAGGTGW TCCARCC-3'。

PCR反應體系：10×Taqbuffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）2.5 mmol/L 4 μL，MgCl（225 mmol/L）2.5 μL，PCR引物各5 μL，Taqplus DNA polymerase 2 μL，加滅菌雙蒸水補至50 μL。

PCR反應條件為：94℃、3min；94℃、1min，54℃、1min，72℃、1 min，30個循環：72 ℃、5 min。

PCR產物與PMD19-T載體（TaKaRa）按PMD19-TVector Cloning試劑盒說明書進行連接，鑒定正確后，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology informa tion，NCBI），用基本局部比對搜索工具（basiclocalalignment search tool，BLAST）工具與GenBank中的16S rDNA序列進行同源性分析并利用MEGA 4軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 發酵香腸中生物胺的測定

（1）發酵香腸制作工藝

取豬后腿瘦肉80%、豬背脊20%進行絞碎、腌制、斬拌之后加入發酵劑和添加劑（鹽2.5%（質量分數）、蔗糖0.5%，葡萄糖0.5%，亞硝酸鈉0.015%，硝酸鉀0.02%，抗壞血酸0.05%）灌腸，在22～25℃，相對濕度90%～95%條件下發酵3 d，然后轉入10～13℃，相對濕度70%～80%環境下成熟25 d，得發酵香腸。

（2）發酵香腸生物胺含量測定

取5g發酵香腸樣品，與20 mL0.4 mol/L的高氯酸混勻，冷凍離心10 min（4℃、4 000 r/min），將上清液倒入50 mL容量瓶中，將沉淀部分重復上述操作，上清液再次倒入上述50 mL容量瓶中并用0.4 mol/L的高氯酸定容。按1.3.2方法，取1 mL樣液進行柱前衍生，利用高效液相色譜對發酵香腸中的生物胺含量進行測定，用氨基酸標準曲線對發酵香腸中生物胺含量進行定量分析。

1.3.5 數據分析

所有數據均為3次以上實驗的平均值，采用SPSS 21.0軟件對數據進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），并進行顯著性比較，若P＜0.05，則差異顯著，若P＞0.05，則無顯著差異。

2 結果與分析

2.1 不產生物胺菌株分離篩選

菌株產生的生物胺呈堿性，使培養基的pH值增加，指示劑溴甲酚紫從黃色變為紫色，而不產胺菌株培養基不變色。將從發酵肉制品中分離的菌株接種到雙層顯色下層培養基上培養48 h后，倒上一層上層培養基顯色。從中式發酵肉制品中篩選出的65株耐鹽耐亞硝酸鹽乳酸菌中，11株表現為陰性，即倒入上層培養基后不變色（呈黃色），為不產胺菌；54株菌表現為陽性，即倒入上層培養基后變為紫色，為產胺菌。選取11株不產胺菌（分別編號為1#～11#）為研究對象進行后續研究。

2.2 菌株生物胺降解能力檢測

將篩選出的11株不產生物胺的乳酸菌進行降解生物胺能力評價，結果見表2。由表2可知，11株不產生物胺的乳酸菌中大部分菌株能夠選擇性降解生物胺，菌株3#不具備降解生物胺的能力，菌株9#可降解8種生物胺，對色胺、尸胺的降解率分別達到了（65.64±5.21）%、（62.68±4.98）%，顯著高于其他菌株（P＜0.05），對苯乙胺、腐胺、組胺和亞精胺等生物胺的降解率也顯著高于其他菌株（P＜0.05）。因此，選擇菌株9#并將其重新編號為PL-ZL001，進行后續實驗。

表2 菌株對生物胺降解能力的比較Table 2 Comparison of biogenic amines degradation ability of different strains

2.3 菌株的鑒定

2.3.1菌株的形態學、生理生化特性鑒定

挑單菌落將菌株PL-ZL001進行培養，其菌落及細胞形態見圖1。由圖1A可知，菌落不透明，呈類圓形，邊緣整齊；由圖1B可知，菌體呈短桿狀，端圓。

圖1 菌株PL-ZL001的菌落（A）及細胞（B）形態Fig.1 Colony(A)and cell(B)morphology of strain PL-ZL001

菌株PL-ZL001具有耐中溫的特性，在最高溫度達42℃的條件下仍可生長，最適生長溫度為30～37℃。此外，該菌能在pH 4.0～10.0的范圍內生長，最適生長pH為7.2，在0～10%NaCl的LB液體培養基均能生長，最適NaCl濃度為2%。利用法國梅里埃API鑒定系統對篩選菌株PL-ZL001進行生理生化鑒定實驗，結果見表3。由表3可知，在糖類物質中，D-海藻糖、D-蔗糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-龍膽二糖、D-松三糖、D-土倫糖和D-麥芽糖等均為陽性，D-阿拉伯糖、D-棉子糖、D-來蘇糖、D-塔格糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖等均為陰性，鑒定百分率為99.0%，T值為0.5，初步鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

表3 菌株PL-ZL001的生理生化鑒定實驗結果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain PL-ZL001

續表

2.3.2 菌株的分子生物學鑒定

通過PCR擴增獲得菌株9#的16S rDNA序列，所測得到的序列長度為1 450 bp，測序結果良好，通過GenBank的序列登錄，將序列比較并構建發育樹，結果見圖2。由圖2可知，將該菌株的16S rDNA序列與NCBI BLAST中的核酸庫進行比對，得到菌株PL-ZL001與植物乳桿菌CP011769.1在同一分支、距離最近，因此，菌株PL-ZL001被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖2 基于16S rDNA序列菌株PL-ZL001的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain PL-ZL001 based on 16S rDNA sequences

2.4 菌株PL-ZL001生物胺降解驗證實驗結果

選取發酵肉制品中常用的木糖葡萄糖球菌與菌株PL-ZL001在發酵香腸中開展降解驗證實驗，以不添加菌種的樣品為空白對照進行生物胺降解驗證實驗，生物胺含量測定結果見表4。

表4 添加不同發酵劑發酵香腸中生物胺含量的測定結果Table 4 Determination results of contents of biogenic amines in fermented sausages after adding different startersmg/kg

由表4可知，添加木糖葡糖球菌（Staphylococcusxylosus）與菌株PL-ZL001的產品中生物胺含量，除苯乙胺和亞精胺以外，含量均顯著降低（P＜0.05），降解率結果見表5。由表5可知，與空白對照組相比，添加植物乳桿菌PL-ZL001可顯著降低色胺、組胺、精胺等生物胺的含量（P＜0.05），降低幅度為10.92%～70.41%，其中以色胺降低幅度最大，為70.41%，這與之前的報道稱添加植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）能抑制色胺和苯乙胺的產生、降低發酵香腸中生物胺的含量等結論一致，其機制可能是通過改變脫羧酶的活性來降低香腸中生物胺的含量[16-20]。

表5 木糖葡糖球菌和植物乳桿菌在發酵香腸中生物胺降解率Table 5 Biogenic amine degradation rate of Staphyloccus xyloseand Lactobacillus plantarumin fermented sausages%

3 結論

本研究從發酵肉制品中篩選出65株耐鹽耐亞硝酸鹽的乳酸菌，對菌株的生物胺降解能力進行定性、定量檢測，從中篩選出1株降解生物胺效率最高的菌株PL-ZL001。由形態學特征、生理生化特性，并結合16SrDNA序列分析，鑒定菌株PL-ZL001屬于植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）。將其作為香腸發酵劑，對發酵香腸的生物胺含量進行測定，結果表明，添加植物乳桿菌PL-ZL001可以抑制香腸中6種生物胺的積累，尤其是對毒性最大的組胺，控制效果最顯著（P＜0.05）。本研究為發酵肉制品中的發酵劑篩選、開發和發酵產品的營養功能提升提供了一定的理論依據。