山西太子灘溫泉土壤放線菌多樣性及功能基因篩選的研究

鄭 潔，庹 利，2，李 偉，保玉心，2*

（1.遵義醫科大學 醫學與生物學研究中心，貴州 遵義 563006；2.遵義市理化分析測試工程研究中心，貴州 遵義 563006）

放線菌是原核生物中經濟和生物學上最具有價值的細菌，可以產生各種生物活性物質，如抗生素、抗腫瘤藥物以及生物酶等[1]。目前，放線菌已成為新型抗生素生產的主要來源之一，包括最重要的抗菌藥物，如β-內酰胺、四環素、利福霉素、氨基糖苷、大環內酯和糖肽[2]。因此，放線菌在天然化合物開發方面具有至關重要的作用和潛力[3]。據統計，已發現超過一半以上的天然活性物質來自于放線菌[4]。然而，隨著抗生素的大規模使用，病原菌耐藥性逐漸增加，使得現有的抗生素越來越不足以應對，因此迫切需要產生新的抗生素。現代基因組研究成果表明，特殊生境可能蘊藏著新物種，而新物種可能具有合成新化合物的基因，因此從特殊生境中發現放線菌資源是尋找新化合物的有效方法[5]。

由于溫泉的持續高溫環境條件及其獨特的物理化學特征，促進了特殊微生物群的形成，因此在溫泉環境中，聚集了大量適合極端環境條件生存的微生物如嗜熱菌[6]。近年來，由于高通量測序技術的發展和宏基因組學方法的出現，國內外越來越多的學者開始關注溫泉微生物群體的多樣性以及功能基因分析[7]。關于溫泉微生物多樣性以及篩選抗生素合成相關基因的研究具有良好的醫學應用前景。RUCKMANI A等[8-9]分別研究印度高止山脈西部溫泉和哥倫比亞安迪斯山脈的El Coquito酸性溫泉中的微生物多樣性。肖凱等[10]研究廣東金山溫泉微生物的多樣性，發現菌株S-X2與嗜熱藍細菌聚球藻BP-1（47118315）具有高度的相似性。近年來，對于溫泉中放線菌的多樣性和抗生素合成基因篩選的研究很少。1991年，徐麗華等[11]研究發現，在云南安寧溫泉次生林中共分離到放線菌8個種屬。王勇等[12]研究發現，長白山的不同環境以及溫泉中采集的土樣中分離出來的BOS-009菌株具有一定的抗植物病原菌作用。

山西省是我國的內陸省份，也是地熱資源豐富的地區，溫泉遍布全省，其中大多數溫泉集中分布在某一區域[13]。山西太子灘溫泉屬于地熱井水，水溫達46.5℃。本研究以太子灘溫泉地熱井周圍的土壤樣品為研究對象，通過對土壤中的放線菌進行分離鑒定并對其菌株進行功能基因篩選，旨在探索放線菌新物種及其潛在活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土壤樣品

2018年2月采集于太子灘溫泉泉眼周圍土壤樣品4份（編號：W1、W2、W3、W4），樣品采集信息如表1。

表1 采集的土壤樣品信息Table 1 Information of collected soil sample

1.1.2 培養基

（1）分離培養基

高氏1號培養基（M1）：可溶性淀粉 20.0 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，瓊脂20.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

自來水酵母粉瓊脂培養基（M2）：酵母浸汁0.25 g，K2HPO40.5 g，瓊脂18.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

葡萄糖酵母麥芽（glucose yeast malt extract，GYM）培養基（M3）：葡萄糖4.0 g，CaCO32.0 g，麥芽抽提物10.0 g，瓊脂粉15.0 g，酵母抽提物共4.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

牛肉膏蛋白胨培養基（M4）：牛肉膏5.0 g，氯化鈉5.0 g，蛋白胨10 g，瓊脂15.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

LB培養基（M5）：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl0.5g，瓊脂15.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

大豆酪蛋白瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養基（M6）：TSA30.0g，瓊脂20.0g，加雙蒸水定容至1L。

（2）純化培養基

鏈霉菌培養基二號ISP2培養基：葡萄糖4.0 g，酵母粉4.0 g，麥芽浸粉10.0 g，瓊脂20.0 g，加雙蒸水定容至1 L。

1.1.3 主要試劑

2×EasyTaq SuperMix、pEASY-T1 Cloning Kit、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、Trans-T1感受態細胞、DNAMarker、X-gal、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物27F和1492R，A3F和A7R，K1F和M6R，KSα和KSβ：上海生物工程股份有限公司；High Fidelity PCR Super Mix：北京全式金生物技術有限公司；Chelex-100樹脂，美國BioRad公司；瓊脂糖、TAE緩沖液：購自北京索萊寶公司；萘啶酮酸（20 mg/L）、重鉻酸鉀（60 mg/L）[14]：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BSC-1600IIA2生物安全柜：蘇州安泰空氣技術有限公司；ZXSD-B1270生化培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；SHKE481HP型落地式恒溫制冷搖床：美國Thermo公司；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋：日本Tomy公司；Microfuge系列臺式微量離心機：美國Beckman公司；聚合酶鏈式反應（polymeras chain reaction，PCR）T100擴增儀、Gel DocTMXR+凝膠成像儀：美國BioRad公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理與菌株的稀釋平板分離

菌種分離前2周，取等量土壤樣品置于培養皿中，自然風干。將風干后的土壤研磨過篩后，每份樣品取2 g放入裝有18 mL無菌水的離心管中，28℃、180 r/min振蕩過夜。然后取樣品進行10倍梯度稀釋，使其終濃度為10-2和10-3。取終濃度為10-3樣品200μL涂布于上述分離培養基上，倒置放于28℃培養箱中培養4～8周。

1.3.2 菌株的純化及保藏

觀察分離培養基上的菌落形態和生長狀況，并用肉眼判斷將放線菌菌落進行編號。挑取單菌落于ISP2固體平板上，采用四區劃線法進行純化，重復這一過程直至得到純培養物。同時，將生長好的菌落置于20%甘油中-80℃保存。

1.3.3 基于16S rRNA基因序列的系統發育分析

（1）16S rRNA基因測序和分析

按Chelex-100法進行菌株DNA的提取[15]。PCR擴增引物為通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）'和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）'。PCR反應體系：2×EasyTaqSuperMix 25 μL，27F引物2 μL，1492R引物2 μL，模板2 μL，無菌水19 μL。PCR反應條件：95 ℃、5 min；94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、2 min，35個循環；72 ℃、10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，將電泳檢測結果顯示為陽性的PCR擴增產物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

（2）序列分析和系統發育樹構建

測序獲得的16S rRNA基因序列利用EzBioCloud（http：//www.ezbiocloud.net）[16]數據庫中的EzTaxon在線比對服務進行相關標準菌株的相似性比對搜索，確定菌株的分類學地位，并從中調出相關的標準菌株的序列作為參比對象，用ClustalX[17]軟件進行多序列比對，采用MEGA 5.0[18]軟件以鄰接法（neighbor-joining，NJ）[19]進行聚類分析并構建系統發育樹，系統進化矩陣根據Kimura-2-parameter模型估算，重復取樣1000次進行自展值分析以評估進化樹拓撲結構的穩定性。

1.3.4 抗生素生物合成基因的探測

放線菌基因組DNA的提取同1.3.3（1），以基因組DNA作為模板PCR擴增非核糖體多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPS）基因A結構域（引物A3F：5'-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3'；A7F：5'-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3）'[20]。PCR擴增反應條件：95℃、5min；95℃、0.5 min，59 ℃、2 min，72 ℃、4 min，35個循環；72℃、10min。擴增I型聚酮合酶（I type polyketide synthase，PKSI）基因KS結構域（引物K1F：5'-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3'；M6R：5'-CGCAGGTTSCSGTACCAGTA-3）'[20]。PCR擴增反應條件：95℃、5 min；95℃、0.5min，59℃、2min，72℃、4min，35個循環；72℃、10min。擴增II型聚酮合酶（IItypepolyketide synthase，PKSII）基因KS結構域（引物KSα：5'-TSGCSTGCTTGGAYGCSATC-3'；KSβ：5'-TGGAANCCGCCGAABCCTCT-3）'[15]，擴增反應條件：96℃、2min；96℃、1 min，60℃、2 min，73 ℃、1.5 min，35個循環；72 ℃、8.5 min。PCR反應體系都為50 μL，其中模板DNA 2 μL，A3F/A7R（10 μmol/L）、K1F/M6R（10 μmol/L）、KSα/KSβ（10 μmol/L）分別為2 μL，2TaqPCR Master Mix為25 μL，用ddH2O補至50 μL。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像儀觀察結果。

2 結果與分析

2.1菌種分離結果

使用6種分離培養基分離從曲沃太子灘溫泉周圍收集的4份土壤樣品中的放線菌。根據放線菌菌落形態初步篩選，選擇111株菌進行16S rRNA基因序列擴增和序列分析。結果表明，104株菌的16S rRNA基因序列比對結果是放線菌。4個樣品中，1號土壤樣品中分離到的放線菌數量最多，為34株，其次是3號土壤樣品，分離到放線菌27株。從不同培養基中分離的放線菌數量如表2所示。

表2 6種培養基分離放線菌的結果Table 2 Result of actinomycetes isolated by 6 media

由表2可知，在6種分離培養基中，從M2培養基中分離的放線菌數量最多，為24株，M1培養基分離的菌數最少。不同培養基中分離的菌株具有特殊性，植物桿菌屬（Plantibacter），紅球菌屬（Rhodococcas）為M2培養基所分離，原小單胞菌屬（Promicromonospora）為M3培養基所分離，壤霉菌屬（Agromyces）為M4培養基所分離，纖維菌屬（Cellulosimicrobium）為M5培養基所分離，（Pseudomonas）為M6培養基所分離。根據分離到的菌株數量及種屬數目，M2培養基和M6培養基的菌數量和種屬數目較多，可能較適合培養溫泉來源的放線菌。

2.2 土壤放線菌多樣性分析

104株菌的分布情況如表3所示，部分菌株的系統發育樹構建結果見圖1。由表3可知，分離到的104株放線菌分布于3目、5科、12屬，分別是鏈霉菌科的鏈霉菌屬（Streptomyces）；微桿菌科的壤霉菌屬（Agromyces）、微桿菌屬（Microbacterium）、植物桿菌屬（Plantibacter）和短小桿菌屬（Curtobacterium）。微球菌科的Pseudarthrobacter屬、節桿菌屬（Arthrobacter）和Paenarthrobacter屬；原小單胞菌科的原小單胞菌屬（Promicromonospora）和纖維菌屬（Cellulosimicrobium）；Nocardio科的類諾卡氏菌屬（Nocardioides）和紅球菌屬（Rhodococcus）。其中，鏈霉菌76株，占所分離菌株的73.07%，屬優勢種；微球菌科最具多樣化，包括6株微桿菌屬、5株壤霉菌屬、2株植物桿菌屬和1株短小桿菌屬。就放線菌的多樣性而言，從太子灘溫泉附近的土壤中所獲得的稀有放線菌和種屬數量相對較高，多樣性較好。

表3 104株放線菌的多樣性分布情況Table 3 Diversity and distribution of 104 actinomycetes

圖1 基于16S rRNA序列構建的部分菌株的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of partial strains based on 16S rRNA gene sequences

2.3 土壤放線菌新穎性分析

以98.65%作為區分兩個原核物種的“金標準”[21]，即菌株16S rRNA基因序列最大相似率低于98.65%的視為潛在新物種，對山西太子灘溫泉放線菌進行新穎性分析，結果見圖2。

圖2 基于16S rRNA基因序列構建的菌株M6W4-7-2的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain M6W4-7-2 based on 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，有一株菌的16SrRNA基因序列相似率低于98.65%，菌株編號為M6W4-7-2，其與最近發表菌株Streptomyces ruberNRRC 14600T（GenBank 登錄號：AB184604）的相似率為98.58%，在基于16S rRNA基因序列構建的NJ法系統發育樹中，菌株M6W4-7-2在Streptomyces屬中形成單獨的一個分支。基于相似率和進化樹分析，推測菌株M6W4-7-2可能為鏈霉菌科鏈霉菌屬的潛在新種，但是其確切的分類地位需要進行形態特征分析、生理生化特性分析等分類工作來確定。

2.4 NRPS、PKS I和PKS II基因的篩選結果

放線菌的抗菌活性與其產生的次級代謝產物密切相關，而微生物次級代謝產物中的主要結構是通過非核糖體多肽合成酶和聚酮合酶合成[22]。微生物次級代謝產物是重要的藥物來源，但是傳統方法獲得活性次生代謝產物存在代謝量低，很難檢測及提純等諸多因素的限制[23]。近年來，隨著生物技術和生物信息學的快速發展，許多微生物活性次生代謝產物的生物合成機制已得到解釋。它為通過篩選功能基因預測微生物活性次生代謝產物的結構和類型提供了理論基礎[24]。從分離的放線菌菌株中隨機篩選出69株菌進行NRPS、PKS I和PKS II生物合成基因的PCR篩選，結果如圖3所示，篩選電泳圖結果見圖4。

圖3 NRPS、PKS I和PKS II基因的PCR篩選結果Fig.3 Screening results of genes from NRPS,PKS I and PKS II by PCR

其中，NRPS、PKS I以及PKS II基因PCR擴增片段長度分別是在700～800 bp、1 200～1 400 bp和600 bp左右。48株放線菌含有至少一種生物合成基因，總陽性率為69.5%。其中，含有PKS II基因的陽性菌株數目與NRPS基因的陽性菌株數均為27株，含有PKS I基因的放線菌有15株，5株同時含有三種生物合成基因。同時還發現，潛在新種菌株M6W4-7-2同時具有NRPS、PKS II兩種抗生素合成基因。因此，對該區域土壤樣品的采集以及對菌株M6W4-7-2活性次生代謝產物的分離與鑒定將是下一步研究工作的重點，以期發現該區域土壤中存在的潛在放線菌新種以及從菌株M6W4-7-2中獲得新穎的生物活性物質，為放線菌次生代謝產物的進一步開發應用提供理論依據。

圖4 NRPS基因（A）、PKS I基因（B）、PKS II基因（C）篩選電泳圖Fig.4 Electrophoregram of genes screening from NRPS(A)、PKS I(B)、PKS II(C)

3 結論

以山西太子灘溫泉周圍土壤樣品為研究對象，選用6種分離培養基對土壤中的放線菌進行分離鑒定與抗生素合成基因的篩選。結果表明，4份土壤樣品中共分離得到104株放線菌，分布于放線菌域的3目、5科和12屬。隨機選取69株放線菌進行功能基因篩選，有69.5%的放線菌具有至少一個生物合成基因簇，陽性率較高。這說明山西太子灘溫泉周圍土壤中放線菌具有豐富的多樣性和抗生素產生潛力，是后期放線菌分離方法研究的高質量材料，能為尋找新活性新結構化合物提供可能存在的潛力菌株。