豬胰臟中胰蛋白酶提取條件優化

岳曉禹，范露露，蔡青和，李長濱，楊盛茹

（河南牧業經濟學院食品與生物工程學院，河南鄭州450046）

在悠長的農業歷史和獨特的飲食文化的影響下，中國人對豬肉有種特殊的喜好，也使得中國成為世界第一的生豬養殖和消費大國[1]。肉制品消費的數量龐大，導致大量不可食用的胰臟造成浪費，胰臟中含有的酶容易自溶，直接導致了環境的污染。胰臟含有多種可以利用的酶資源，從其中提取這些酶，不僅可以廢物利用而且保護環境。

豬胰臟中最重要的酶之一就是胰蛋白酶，具有很高的經濟價值。從動物胰臟中提取的胰蛋白酶屬于中外藥典收錄的助消化藥。胰蛋白酶是一種堿性蛋白酶[2]，屬于水解酶的一種[3]。前體無活性，受腸激酶的刺激被激活。不同來源的胰蛋白酶相對分子質量不同，但大都在24 000 Da左右，等電點為10.8，最適pH值為7.6～8.0[4]。胰蛋白酶一般存在于高等動物胰液和低等動物胃液中[5]，作用特性單一[6]，只專一作用于精氨酸和賴氨酸參與形成的肽鍵，促進絲氨酸殘基中蛋白質的斷裂，在動物的消化系統中被發現，通常用于消化細胞間的軟組織[7]。胰蛋白酶在各種行業中仍然有很大的需求[8-9]。臨床上應用于外科炎癥、潰瘍、膿胸、血胸、創傷性損傷等。除了其的臨床意義外，在牛奶工業、蛋白質組學和各種食品加工工序中也有著極高的應用，特別是在動物細胞組織培養實驗室有著極其廣泛的應用[10]。

國內外專家學者對提取胰蛋白酶方面有不少的研究，早些時候提取胰蛋白酶大都采用低溶度有機溶劑（如25%乙醇、10%丙酮、7.5%異丙醇等）提取，通過氯化鈣和胰酶粉進行激活，最后用高濃度有機溶劑沉淀的方法。但近些年來提取胰蛋白酶的工藝有了很大的改變，因為有機溶劑的毒性和對人體的危害，各位專家學者開始使用非有機溶劑對胰蛋白酶進行提取，在激活劑和保護劑的選擇上也有了很多的改變。如周紅航等[11]采用蒸餾水提取，氯化鈣和胰酶粉激活，根據胰蛋白酶各方面的性質用聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系對胰蛋白酶進行純化，最后酶活達到了1780U/mL；劉亮亮等[12]在2010年研究了胰蛋白酶提取工藝，采用Tris-HCl緩沖液為提取劑，氯化鈣和胰蛋白酶粉為激活劑，鹽析方法進行提純，最終酶比活力達到6600BAEE/mg，該方法雖然具有很高的提取效率，但要消耗大量的有機溶劑；余武英等[13]在2011年也采用蒸餾水提取，氯化鈣和胰酶粉激活，用聚乙二醇使胰蛋白酶得到沉淀分離，最終酶活力達到1 600 U/mL以上，比鹽析法提取率高，操作簡單；丁凌霄等[14]在2013年用乙酸酸化水提取，鹽析法粗提，氯化鈣和胰蛋白酶激活，親和層析分離純化胰蛋白酶，酶活達到256 U/mL；李明生等[15]在2017年用蒸餾水提取，通過對激活條件的優化研究出當氯化鈣濃度為0.2 mol/L為最佳激活條件，經二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-瓊脂糖凝膠FF純化后其酶活力為3980U/mg，酶活得到顯著提高。

本試驗對胰蛋白酶制備進行研究，以期減少有機溶劑在提取過程中的使用，相對提高胰蛋白酶的活力，打破有機溶劑消耗量大的問題，減少有機溶劑對環境和人體的危害。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍豬胰臟、豬十二指腸、膽囊：某公司提供；Tris-HCl緩沖液、三羥甲基氨基甲烷：合肥博美生物科技有限責任公司；干酪素：國藥集團化學試劑有限公司；酪氨酸對照品：德國Sigma公司；NaCl、Na2HPO4：天津市永大化學試劑有限公司；KH2PO4：北京西隴化工股份有限公司；試驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PY-790絞肉機：中山市鵬宇電器有限公司；IS139FD-V2 pH計：上海儀邁儀器科技有限公司；UV759CRT紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬胰臟中胰蛋白酶提取工藝試驗流程及操作要點

冷凍豬胰臟打漿→提取→激活→濃縮→胰蛋白酶

操作要點：

冷凍豬胰臟打漿：實驗先用剪刀去除大塊脂肪、結締組織，再用絞肉機來破碎胰臟。

提?。喝?0 g胰漿，按200 mL/100 g比例加入20 mL提取劑（預冷至4℃）進行提取，使胰蛋白酶細胞充分溶解在溶液中。胰蛋白酶的活性在4℃時比較穩定[16]，所以整個操作過程在4℃條件下進行。

激活：在上述溶液中加入激活劑激活胰蛋白酶，在此過程中為了減少蛋白酶的降解失活加入1%氯化鈉和1%甘油作為保護劑，調節pH為8.0，充分攪拌，4℃條件下激活18 h，兩層紗布過濾，得到濾液，濾渣再次提取，合并兩次提取液。

濃縮：用截留分子質量為10 000 Da的透析袋對胰蛋白酶液進行濃縮，把透析袋剪成約10 cm的小段，用蒸餾水煮沸10～15 min左右，透析袋的一端用夾子夾到位，取10 mL胰蛋白酶液從透析袋另一端倒入，最后用夾子夾到位。把處理好的裝有胰蛋白酶液的透析袋放入干凈的燒杯中，倒入配好的聚乙二醇（聚乙二醇∶蒸餾水=30∶100），倒入的聚乙二醇的量以正好浸入透析袋為準，最后在4℃條件下進行濃縮。燒杯中的聚乙二醇1～2h換一次，5～6h換一次，最后放置過夜，制成胰蛋白酶。

1.3.2 胰蛋白酶活力測定

按《中國藥典》2015年版第二部進行測定[17]。測定過程稍有改動，因為測定的胰蛋白酶液是液體，所以藥典中用氯化鈣溶液溶解定容胰蛋白酶粉的過程省略，其余步驟和藥典都相同。

胰蛋白酶活力定義：每分鐘水解酪蛋白生成三氯醋酸不沉淀物在波長275 nm處與1 μmol酪氨酸相當的酶量，為1個胰蛋白酶活力，U/mL。

1.3.3 胰蛋白酶提取工藝優化單因素試驗

分別考察不同提取劑（0.15 mo1/L氯化鈉、蒸餾水、磷酸鹽緩沖液（pH6.8）、0.05 mo1/L Tris-HCl緩沖液），激活劑（0.06%CaCl2+豬十二指腸（豬胰臟∶十二指腸=8∶1，下同），0.2%CaCl2+1%膽汁，0.2%CaCl2+1%胰酶粉，0.2%CaCl2+豬十二指腸），提取pH值（2、4、6、8、10、12、14），提取時間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h）對胰蛋白酶酶活的影響。

1.3.4 胰蛋白酶提取工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，設計L9（34）正交試驗確定最優方案。

表1 豬胰臟中胰蛋白酶提取條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of extraction conditions of trypsin in pig pancreas

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取劑種類對胰蛋白酶酶活的影響

圖1 提取劑種類對胰蛋白酶酶活的影響Fig.1 Effect of types of extraction enzymatic activity of trypsin

由圖1可知，當提取劑為0.15 mol/L NaCl時，胰蛋白酶酶活較低，為150 U/mL；當提取劑分別為蒸餾水、磷酸鹽溶液、0.05 mol/L Tris-HCl時，胰蛋白酶酶活分別為171 U/mL、176 U/mL、187 U/mL，沒有顯著差異（P＞0.05）。但是因為Tris-HCl是有機溶劑，大量使用會造成浪費和環境污染，所以不宜使用，因此選擇蒸餾水、磷酸鹽緩沖液、0.15 mol/L Tris-HCl進行后續試驗。

2.1.2 激活劑種類對胰蛋白酶酶活的影響

圖2 激活劑種類對胰蛋白酶酶活的影響Fig.2 Effect of activation agents types on enzymatic activity of trypsin

由圖2可知，當激活劑為0.2%CaCl2+1%膽汁時，蛋白酶酶活為120 U/mL；當激活劑分別為0.2%CaCl2+1%胰酶粉、0.2%CaCl2+豬十二指腸、0.06%CaCl2+豬十二指腸時，酶活分別為221 U/mL、244 U/mL、268 U/mL，沒有顯著差異（P＞0.05），因此選擇0.2%CaCl2+1%胰酶粉、0.2%CaCl2+豬十二指腸、0.06%CaCl2+豬十二指腸進行后續試驗。

2.1.3 提取pH值對胰蛋白酶酶活的影響

圖3 提取pH值對胰蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effect of extraction pH on enzymatic activity of trypsin

由圖3可知，胰蛋白酶酶活隨著pH值的升高呈先升高后降低的趨勢。在pH2～8范圍內，酶活力差異顯著（P＜0.05），在pH=8時酶活達到最高，為215 U/mL，pH值由8升至14時，酶活力急劇下降，差異顯著（P＜0.05）。酸性或堿性過強都會導致胰蛋白酶失活。因此選擇pH值8為最佳提取pH值。

2.1.4 提取時間對胰蛋白酶酶活的影響

圖4 激活時間對胰蛋白酶酶活的影響Fig.4 Effect of activation time on enzymatic activity of trypsin

由圖4可知，隨著激活時間的延長，胰蛋白酶酶活呈先升高后降低的趨勢，在2～18 h范圍內，胰蛋白酶活力急劇增加，差異顯著（P＜0.05），在18 h時酶活達到最高，為342 U/mL，在18～22 h范圍內酶活慢慢下降與最高值沒有顯著差異（P＞0.05），因此選擇最佳激活時間為18 h。選擇最佳激活時間不僅可以充分激活胰蛋白酶，還可以避免激活后胰蛋白酶本身的降解，這是把握激活時間的關鍵[19]。

2.2 正交試驗結果

由表2可知，對酶活影響主次因素為提取pH值＞提取時間＞激活劑＞提取劑。豬胰臟蛋白酶提取最優方案為A3B1C1D2，即提取劑為0.15 mo1/L氯化鈉，激活劑為0.06%的CaCl2和豬十二指腸，提取pH值為6，提取時間為18h。上述得出的最優方案是不是真正的最優方案還需要進一步驗證，將優方案A3B1C1D2與正交表中最好的第6號試驗A2B3C1D2作對比試驗，得出酶活為424 U/mL，比第6號試驗結果高，所以A3B1C1D2為最優方案。

2.3 胰蛋白酶的濃縮

表3 透析前后酶活的變化Table 3 Changes of enzyme activity before and after dialysis

由表3可知，透析24 h后的酶活是藥典要求酶活（每1 g胰酶中含胰蛋白酶活力≥600單位）的4.19倍。選擇透析袋和聚乙二醇吸水相結合的方式對胰蛋白酶進行濃縮，此方法濃縮效果好，操作簡單，經濟成本低。

3 結論

胰蛋白酶制備的最佳提取劑為0.15 mo1/L氯化鈉，激活劑為0.06%的CaCl2和豬十二指腸，提取pH值為6，提取時間18 h，經透析袋濃縮之后酶活達到2 512 U/mL，是藥典要求酶活的4.19倍。本實驗提取胰蛋白酶方法簡單，通過透析對胰蛋白酶液進行簡單的濃縮之后酶活顯著提高，經濟成本低，應用價值高。通過研究發現，提取出來的成品仍存在其他大分子酶，與其他優秀的研究者提取出的蛋白酶酶活相比還是有很大差距，在尋求提取胰蛋白酶更加經濟的方式基礎上，酶活仍存在很大的進步空間。期望在以后的學習和工作中能有機會進一步探討胰蛋白酶的提純進而提高酶活。