乙酰輔酶A羧化酶對乳酸片球菌耐酸性能的影響

于凱慧，張夢涵，高 菁，駱健美*

（天津科技大學 生物工程學院，天津 300457）

山西老陳醋在我國有3 000多年的歷史，通過固態發酵過程中多種微生物的不斷繁殖和演替，產生多種代謝產物，進而賦予產品獨特的口感與風味。酒精發酵階段，糖類物質在微生物及其酶系液化糖化的作用下發酵生成酒精等，醋酸發酵階段，糖類和醇類物質在醋酸菌、乳酸菌等微生物的共同作用下分解代謝生成乙酸、乳酸等酸類物質，同時產生多種風味物質，形成特有的風味[1]。聶志強等[2-3]發現，乳酸菌在山西老陳醋中豐度較高，且存在于食醋釀造各個階段，主要包括食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、乳酸片球菌（Pediococcus acidiactici）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、鼠李糖乳桿菌（Lactob acillus rhamnosus）等。這些不同種類的乳酸菌產生的乳酸、琥珀酸、蘋果酸等有機酸對食醋風味和品質具有重要的作用[4]。反過來，食醋釀造過程中積累的這些有機酸也會對乳酸菌產生脅迫作用。山西老陳醋固態釀造過程中總酸度最高可達5.64 g/100 mL，與之對應的pH在3.5～4.5內波動[3]。因此，研究乳酸菌的耐酸機制，對于深入理解該類微生物在山西老陳醋固態釀造過程中的作用具有重要的科學意義。

目前研究者主要對一些模式微生物（如干酪乳桿菌[5-6]、植物乳桿菌[7-9]、乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）[8-9]、鼠李糖乳桿菌[10]、戊糖乳桿菌[11）]在單一酸壓力（如鹽酸[7-12]和乳酸[13）]下的耐性機制展開了研究。結果發現，乳酸菌的耐酸機制主要包括：維持胞內pH穩態[14-15]；改變細胞膜的組成和流動性[16，17]；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和蛋白質對酸耐受的保護和修復作用[18-19]；糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝等代謝調控[20-21]。目前，以來源于復雜酸性環境的山西老陳醋的乳酸菌為對象，研究其在多種酸壓力下的耐性機制還未見報道。

課題組前期對山西老陳醋固態釀造過程中不同階段（大曲；酒精發酵1d、4d、7d、10d；醋酸發酵0d、3d、5d、7d；陳釀）的樣品總酸度及乳酸菌菌群的耐醋酸性能進行了初步分析。結果表明，醋酸發酵3 d和7 d的樣品總酸度分別為5.24 g/100 mL和6.35 g/100 mL，乳酸菌菌群在3%（V/V）醋酸下混合培養后的培養液具有較高的OD600nm值，這暗示該菌群中的乳酸菌具有較高的酸耐受能力[22]。在此基礎上，本論文對上述菌群中分離純化得到的8株乳酸菌分離株（瑞士乳桿菌AAF3-1、干酪乳桿菌AAF3-2、乳酸片球菌AAF3-3、干酪乳桿菌AAF3-5，來源于醋酸發酵3 d；食竇魏斯氏菌AAF7-1、食竇魏斯氏菌AAF7-2、干酪乳桿菌AAF7-4、乳酸片球菌AAF7-5，來源于醋酸發酵7 d）的耐醋酸性能展開進一步分析，篩選獲得了耐醋酸性能優良的乳酸片球菌，利用定量實時聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）對蛋白質組學技術初篩得到的在三種酸壓力（醋酸、乳酸、鹽酸）下表達水平均顯著上調的蛋白——乙酰輔酶A羧化酶編碼基因的轉錄水平進行檢測。之后，利用過表達技術，探討該基因對乳酸片球菌耐酸性能的影響，為山西老陳醋固態釀造過程中乳酸菌的耐酸機制和耐酸性能調控研究提供了重要的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

本實驗所用菌株和質粒見表1。

表1 本實驗所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in the experiment

1.1.2 材料與試劑

TransStart Fast Pfu DNA Polymerase酶（2.5 U/μL）：北京全式金生物技術有限公司；DL 5000 marker、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix ExTaqGC試劑盒：寶生物（大連）有限公司；細菌基因組提取試劑盒（DP302）：北京天根生化科技有限公司；Plasmid Mini Kit I、Gel Extraction Kit、Cycle-Pure Kit：美國Omega公司；EastepTM總RNA提取試劑盒：上海普洛麥格生物有限公司；ClonExpress One Step Cloning Kit：南京諾唯贊生物科技有限公司；其余試劑為生化試劑或化學純試劑，均購自天津市福晨化學試劑廠。

1.1.3 培養基

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH 7.2，121℃滅菌20 min。

LB固體培養基：LB液體培養基中加入20 g/L的瓊脂，121℃滅菌20 min。

MRS液體培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉提取物10 g，酵母提取物5 g，無水乙酸鈉5 g，吐溫80 1mL，檸檬酸銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，調節pH至6.2～6.8，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

MRS固體培養基：MRS液體培養基中加入20 g/L的瓊脂，121℃滅菌20 min。

復蘇培養基：MRS液體培養基中加入0.5mol/L的蔗糖，115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

GHP-9270恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；GI54D高壓蒸汽滅菌鍋：美國Zealway公司；DYY-2C電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；ECM 399高壓脈沖電轉儀：北京市六一儀器廠；PHS-3C標準pH計：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計：上海分析儀器廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；Bioscreen C全自動生長曲線分析儀：芬蘭Bioscreen公司；ABI Step-One Plus Real Time PCR System：美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌株的活化和培養

從甘油管中分別吸取菌液，以2%（V/V）接種量接種到裝有5 mL MRS培養基的試管中，37℃恒溫箱中靜置活化培養8h。以2%（V/V）接種量將上述培養液轉接入裝有新鮮的5 mL MRS液體培養基的試管中，37℃恒溫箱中靜置進行一級培養，培養8 h后菌體生長進入對數期（OD600nm值≈1.0）。以1%（V/V）的接種量將一級培養液接入裝液量為100 mL/250 mL的MRS液體培養基中，37℃恒溫箱中靜置進行二級培養。對于工程菌株，培養基中需要加入10μg/mL的氯霉素維持質粒的穩定性。

1.3.2 乳酸菌分離株的生長曲線測定

按照1.3.1的方法進行菌株的活化和一級培養，在二級培養初始將OD600nm值調節為0.1，取300 μL培養液接入殺菌消毒的微生物生長板的微孔中，每株菌設三個平行，放入全自動生長曲線分析儀中，設置溫度環境37℃，設置菌體濃度檢測頻率30 min，培養至微生物生長穩定期。

1.3.3 乳酸菌分離株的耐酸性能分析

菌株在適當酸壓力下的生長性能分析：按照1.3.1的方法進行菌株的活化和一級培養，在二級培養的初始（OD600nm值調節為0.1）向培養基中加入不同的酸壓力（包括2%、3%（V/V）醋酸；1%、2%（V/V）乳酸；pH 5.0、4.0、3.5、3.0（鹽酸調節）），37℃恒溫箱中靜置培養，于不同時間取樣，利用紫外分光光度計測定OD600nm值或者采用平板活菌計數法測定培養24 h時的活菌數，并以不添加壓力條件作為空白對照，計算相對活菌數，其計算公式如下：

菌株在高濃度酸壓力沖擊下的存活性能分析：按照1.3.1的方法進行菌株的活化、一級和二級培養，待二級培養至OD600nm值≈1.0（約8 h）時收集菌體（5 000 r/min、10 min、4℃），并將其重懸于5 mL MRS液體培養基中。將其分成兩份，分別接種到添加壓力（包括含5%（V/V）醋酸，3%（V/V）乳酸，pH 2.5（鹽酸調節））和不添加壓力的裝有新鮮的50mLMRS液體培養基的250 mL三角瓶中。37℃靜置培養，于不同時間取樣，利用平板活菌計數法37℃恒溫箱中培養36～48 h，測定活菌數，計算相對活菌數，或稀釋不同梯度后拍照觀察菌落的存活情況。

1.3.4 基因轉錄水平分析

按照1.3.3的方法將菌株在5%（V/V）醋酸、3%（V/V）乳酸、pH 2.5（鹽酸調節）條件下沖擊90 min后，收集菌體（6 000 r/min、4℃、10 min）。按照EastepTM總RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA。按照PrimeScript real-time reagent Kit說明書以RNA為模板進行反轉錄生成cDNA。設計上游引物5'-CTTACCCAGGAATGGATGCTGAATA-3'，下游引物5'-CAATTACGCTGATGTATGGTACCCG-3'，根據SYBR Premix ExTaqGC試劑盒的說明書，利用ABI Step-One Plus Real Time PCR System儀器進行實時熒光定量PCR。以編碼16S rRNA的基因作為內參，通過比較Ct（2-ΔΔCt方法）計算基因相對表達水平，然后歸一化至未經壓力處理的條件，每個樣品設3個平行，結果取平均值，并用標準偏差顯示其數據的波動。

1.3.5 重組質粒的構建

（1）克隆載體的線性化

線性化克隆載體由反向PCR擴增制備。上游引物5'-TCTAGAGAGCTCAAGCTTTC-3'，下游引物5'-CCATGGTGAGTGCCTCCTTA-3'，反應條件：95 ℃、3 min；95 ℃、10s，55℃、15s，72℃、3min30s，30個循環，使用1%的瓊脂糖凝膠核酸電泳對PCR產物進行驗證。之后加入1μL快切酶DpnI，37℃酶切2 h，進行回收。

（2）目的基因的獲得

按照G+細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取乳酸片球菌AAF3-3的基因組DNA。用核酸分析儀測定DNA的濃度，通過1%瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測，-20℃保存，備用。以基因組為模板，利用上游引物5'-TAAGGAGGCACTCA CCATGGGGATGACAAAAACAGCATATGAAACGG-3'，下游引物5'-GAAAGCTTGAGCTCTCTAGACTAAAATTT ACTAAACCGTTCGTGGC-3'擴增基因acc。該方法應用同源重組原理連接，引物由與線性化質粒兩端互補的堿基序列（下劃線部分）和與目的基因兩端互補的堿基序列（其余部分）兩部分構成。PCR反應條件見1.3.5（1），使用1%瓊脂糖凝膠核酸電泳對PCR產物進行驗證。

（3）重組質粒的構建

按照ClonExpress One Step Cloning Kit的說明書配制連接體系。反應條件：37℃、30 min。將連接產物采用化轉入E.coliMC1061感受態中。挑取轉化子，提取質粒后進行PCR和Hind III單酶切驗證。選擇條帶大小正確的重組質粒送到金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.3.6 過表達菌株的構建

參照RODRíGUEZMC等[23]的方法制備感受態細胞。具體過程為菌株二級培養的初始加入40mmol/L蘇氨酸，37℃恒溫靜置培養8 h至OD600nm值≈1.0，收集菌體（6 000 r/min、4℃、10 min），用含7 mmol/L磷酸鉀緩沖液、1 mmol/L氯化鎂的0.5 mol/L蔗糖溶液洗滌三次，然后再用2 000 U/mL的溶菌酶重懸菌體，37℃、20 min，重復3次，最后用含10%甘油的0.5 mol/L蔗糖溶液重懸分裝。

將測序正確的重組質粒電轉（2 kV/cm，5 ms）進入乳酸片球菌AAF3-3的感受態細胞中，復蘇培養基中37℃靜置培養2 h后涂布于含10 μg/mL氯霉素的MRS固體平板上。37℃恒溫培養箱中培養36～48 h后隨機挑取轉化子，通過質粒PCR和Hind III單酶切進行驗證。實驗中，以含有空質粒的重組菌株作為對照菌株。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離株在無壓力下的生長性能

山西老陳醋醋酸發酵3d的4株乳酸菌分離株（AAF3-1、AAF3-2、AAF3-3、AAF3-5）和7d的4株乳酸菌分離株（AAF7-1、AAF7-2、AAF7-4、AAF7-5）在無壓力下的生長曲線見圖1。由圖1可知，8株菌的生長速率和生理階段劃分沒有明顯差異，均存在明顯的延滯期（0～2 h）、對數期（2～12 h）、穩定期（12～24 h），培養24 h后的最終OD600nm值在1.2～1.4之間波動。這表明上述8株乳酸菌分離株在無壓力下的生長性能沒有明顯差異。

圖1 來源于醋酸發酵3 d和7 d的乳酸菌分離株在無壓力下的生長曲線Fig.1 Growth curves of lactic acid bacteria isolated from acetic acid fermentation for 3 d and 7 d under non-stress condition

2.2 耐醋酸性能優良乳酸菌的篩選

2.2.1 耐醋酸性能優良乳酸菌的初篩

8株乳酸菌分離株在2%（V/V）醋酸下的生長性能見圖2。由圖2（a）可知，8株乳酸菌分離株在2%（V/V）醋酸下沒有明顯的延滯期，分離株AAF3-3、AAF3-1、AAF3-5不僅具有比其他5個分離株更快的生長速率，而且具有更長的對數期（2～12 h）。分離株AAF3-3、AAF3-1、AAF3-5培養12 h后進入穩定期，菌液OD600nm值分別達到了0.46、0.37、0.33，而其他5個分離株則在培養5h后生長趨于平緩，菌液OD600nm值在0.22～0.28之間波動。為更好的反映菌株在醋酸壓力條件下的生長情況，進一步選取上述8株菌培養24 h后的菌液進行活菌數測定并計算相對活菌數。由圖2（b）可知，AAF3-3、AAF3-5、AAF3-1的相對活菌數較高，分別為0.19%、0.18%、0.13%，而分離株AAF7-5、AAF3-2、AAF7-1、AAF7-2、AAF7-4的相對活菌數較低（均＜0.05%）。綜合上述結果，選取AAF3-1、AAF3-3、AAF3-5用于后續復篩。

圖2 8株乳酸菌株在2%（V/V）醋酸下的生長曲線（a）和24 h時的相對活菌數（b）Fig.2 Growth curves(a)and relative number of viable bacteria at 24 h(b)of eight lactic acid bacteria under 2%(V/V)acetic acid stress

2.2.2耐醋酸性能優良乳酸菌的復篩

醋酸發酵3 d的總酸度為5.24 g/100 mL，體積比約為3%（V/V）醋酸。因此，進一步考察了AAF3-1、AAF3-3、AAF3-5三個菌株在3%（V/V）醋酸壓力的生長性能見圖3。由圖3（a）可知，AAF3-3培養6 h后菌液的相對活菌數為0.26%，比AAF3-1（0.066%）和AAF3-5（0.14%）分別高出315.01%和98.65%。隨著培養時間的延長，三個菌株的相對活菌數均明顯下降，其中，AAF3-1和AAF3-5的相對活菌數分別在培養12h和24h后下降為0，而AAF3-3在培養24 h仍保持0.001%的相對活菌數。由圖3（b）可知，5%（V/V）醋酸沖擊30 min后，AAF3-3的相對活菌數為10.67%，相比AAF3-1（0.016%）和AAF3-5（0.29%）分別高出651.93倍和34.92倍。隨著沖擊時間的延長，3個菌株的相對活菌數明顯下降，其中乳酸片球菌AAF3-3在90 min時仍保持將近0.08%的相對活菌數，而AAF3-1、AAF3-5的相對活菌數在沖擊60 min和90 min后分別變為0。因此，3個乳酸菌分離株的耐醋酸性能由高到低排序為AAF3-3＞AAF3-5＞AAF3-1，選取乳酸片球菌AAF3-3作為后續研究對象。

圖3 三個乳酸菌分離株在3%（V/V）醋酸壓力下的生長性能（a）和5%（V/V）醋酸沖擊下的存活性能（b）Fig.3 Growth performance of three lactic acid isolates under 3%(V/V)acetic acid stress(a)and survival performance shocked by 5%(V/V)acetic acid stress(b)

2.3 乳酸片球菌AAF3-3對其他酸壓力的耐受性能

考慮到乳酸片球菌AF3-3是來源于復雜酸環境的食醋固態釀造過程，因此，進一步考察了該菌株對其他酸壓力的耐受性能。

2.3.1 乳酸片球菌AAF3-3在乳酸壓力下的耐酸性能

由圖4（a）可知，菌株AAF3-3在1%（V/V）乳酸下的相對活菌數隨著培養時間的延長呈現增長趨勢，其中，培養6 h的相對活菌數為5.61%，培養24 h后增長為9.01%，這說明，AAF3-3在1%的乳酸壓力下保持良好的生長性能。當乳酸濃度提高至2%（V/V），培養6 h和12 h后的AAF3-3菌液的相對活菌數為0.51%和0.11%，而24 h后下降為0。由圖4（b）可知，AAF3-3在3%（V/V）乳酸下沖擊30 min后的相對活菌數為29.84%。隨著沖擊時間的延長，其相對活菌數明顯下降，當沖擊120 min時，相對活菌數僅為0.0005%。這些結果表明，乳酸片球菌AAF3-3對2%（V/V）和3%（V/V）的乳酸壓力表現出一定的耐受性。

圖4 乳酸片球菌AAF3-3在1%、2%（V/V）乳酸壓力下的生長性能（a）和3%（V/V）乳酸沖擊下的存活性能（b）Fig.4 Growth performance of P.acidilactici AAF3-3 under 1%,2%(V/V)lactic acid stress(a)and survival performance shocked by 3%(V/V)lactic acid stress(b)

2.3.2乳酸片球菌AAF3-3在鹽酸壓力下的耐酸性能

由圖5（a）可知，菌株AAF3-3在pH 5.0下的相對活菌數隨著培養時間的延長呈現緩慢上升的趨勢。這說明AAF3-3在pH 5.0的酸壓力下保持一定的生長能力。當pH降至4.0以下時，隨著培養時間的延長，菌株的相對活菌數呈現下降趨勢。其中pH 3.5條件下，相對活菌數由6 h的1.08%急劇下降為24 h的0.32%，下降了237.50%。pH 3.0條件下，培養6 h后菌液相對活菌數為0.63%，而培養24h后降為0.0013%。這說明pH＜4.0時，鹽酸對菌株產生一定的毒害作用。圖5（b）表明，AAF3-3在pH 2.5條件下沖擊30 min時相對活菌數仍保持在25.98%，而后相對活菌數急劇下降，120 min時僅為0.005 9%。因此，AAF3-3在pH 3.0和pH 2.5的鹽酸壓力下表現出一定的耐受性。

DONATIEN K等[24]對來源于非洲baobab樹種子發酵液中的乳酸片球菌進行了分離純化，并通過檢測菌株在pH 2.5條件下沖擊不同時間后的活菌數對其耐酸性能進行了分析。結果表明，野生型乳酸片球菌菌株L87在pH 2.5條件下呈現緩慢上升的趨勢，對數活菌數由0 h的6.20逐漸增長至2 h的6.69，之后不再增長，而分離菌株L169在pH 2.5條件下的生長則受到了抑制，其對數活菌數由0 h的6.32下降至4 h的6.08。這些結果和本論文的結果共同說明，乳酸片球菌對酸壓力表現出一定的耐受性能。

圖5 乳酸片球菌AAF3-3在pH 5.0、4.0、3.5、3.0（鹽酸調節）下的生長性能（a）和pH 2.5（鹽酸調節）下的存活性能（b）Fig.5 Growth performance ofP.acidilactici AAF3-3 under pH 5.0,4.0,3.5,3.0(adjusted by hydrochloric acid)(a)and survival performance under pH 2.5(adjusted by hydrochloric acid)(b)

2.4 acc在不同種類酸壓力下的轉錄水平

課題前期的蛋白組學工作中，發現在醋酸、乳酸、鹽酸三種壓力高濃度沖擊后，乳酸片球菌AAF3-3中乙酰輔酶A羧化酶（編碼基因為acc）的蛋白表達水平較無壓力條件下均出現了顯著上調，分別為1.26、2.35和2.45倍。乙酰輔酶A羧化酶是催化“乙酰輔酶A+ATP+HCO3-→丙二酰輔酶A+ADP+Pi”反應的生物素酶。此反應制約著脂肪酸合成第一階段的速度，是脂肪酸合成的限速酶[25]，其底物乙酰輔酶A和產物丙二酰輔酶A也分別在丙酮酸代謝和三羧酸循環中扮演重要作用。利用qRT-PCR的方法對acc基因在三種酸壓力下的轉錄水平進行了檢測，結果見圖6。由圖6可知，acc基因在5%（V/V）醋酸、3%（V/V）乳酸、pH 2.5（鹽酸）三種壓力高濃度沖擊下的轉錄水平均出現了顯著上調，分別是菌株在無壓力條件下轉錄水平的4.32倍、2.02倍和1.13倍，這一結果與蛋白組學結果一致，也暗示了該基因在菌株的耐酸機制中發揮著重要作用。

圖6 基因acc在三種酸壓力沖擊下的轉錄水平Fig.6 Transcription level ofaccafter shocked by high concentration acid stresses

2.5 過表達菌株P.acidilactici/pNZ8148-acc的構建

如圖7（a）所示，重組質粒PCR在770 bp左右出現條帶，與基因acc的理論大小768bp相符合。如圖7（b）所示，質粒單酶切在4000bp左右出現條帶，相比空質粒pNZ8148（3167bp）高出約770 bp，與目的基因acc（768 bp）理論大小相符。測序結果進一步證明，重組質粒pNZ8148-acc構建成功。將驗證正確的重組質粒電轉入乳酸片球菌菌株中，通過質粒PCR和Hind III單酶切進一步驗證過表達菌株P.acidilactici/pNZ8148-acc構建成功。

圖7 重組質粒PCR（a）和Hind III單酶切（b）驗證Fig.7 Identification of PCR(a)and single restriction enzyme Hind III digestion(b)of recombinant plasmid

2.6 過表達菌株P.acidilactici/pNZ8148-acc的耐酸性能

對上述構建成功的過表達菌株在適當酸壓力下（包括3%（V/V）醋酸、2%（V/V）乳酸、pH 3.0（鹽酸調節））的生長性能和高濃度酸沖擊下（包括5%（V/V）醋酸，3%（V/V）乳酸和pH 2.5（鹽酸調節））的存活性能進行分析。由圖8（a）可知，過表達菌株在3%（V/V）醋酸下培養6 h和24 h的相對活菌數分別為12.93%和0.04%，相比對照菌株分別提高了46.10%和24倍。如圖9（a）所示，過表達菌株經5%（V/V）醋酸沖擊90 min后及沖擊180 min后的活菌數仍分別保持在104、103數量級，而對照菌株則分別保持在102數量級及沒有明顯存活。這些結果表明，acc基因對乳酸片球菌的醋酸耐受性具有正向調控作用。

圖8 過表達菌株P.acidilactici/pNZ8148-acc在3%（V/V）醋酸壓力（a）、2%（V/V）乳酸壓力下（b）以及pH 3.0（鹽酸調節）下的生長性能（c）Fig.8 Growth performance ofP.acidilactici/pNZ8148-accunder 3%(V/V)acetic acid stress(a),2%(V/V)lactic acid stress(b)and pH 3.0(adjusted by hydrochloric acid)(c)

圖9 過表達菌株P.acidilactici/pNZ8148-acc在3%（V/V）醋酸壓力（a）、2%（V/V）乳酸壓力下（b）以及pH 3.0（鹽酸調節）下的存活性能（c）Fig.9 Survival performance ofP.acidilactici/pNZ8148-accunder 3%(V/V)acetic acid stress(a),2%(V/V)lactic acid stress(b)and pH 3.0(adjusted by hydrochloric acid)(c)

由圖8（b）和圖9（b）可知，2%（V/V）乳酸壓力下，P.acidilactici/pNZ8148-acc培養6 h時的生長性能不及對照菌株，推測可能是還未適應該環境。而培養24 h后的相對活菌數為0.46%，比對照菌株（0.17%）高出170.59%。在3%（V/V）乳酸下，隨著沖擊時間的延長，P.acidilactici/pNZ8148-acc在90 min后活菌數比對照菌株高出1個數量級，沖擊時間延長到180 min后，過表達菌株仍能保持103的活菌數，而對照菌株的菌落數極少。這表明，基因acc可以明顯改善菌株對乳酸壓力的耐受性。

由圖8（c）可知，P.acidilactici/pNZ8148-acc在pH3.0下培養6 h時與對照菌株生長性能無明顯差別，培養24 h的相對活菌數（6.61%）較對照菌株（1.47%）高出349.66%。由圖9（c）可知，pH 2.5下沖擊90 min后，P.acidilactici/pNZ8148-acc無活菌數，而對照菌株仍保持在103數量級。沖擊180 min后P.acidilactici/pNZ8148-acc與對照菌株均未有存活。表明基因acc可以在一定pH范圍內改善菌株對鹽酸壓力的耐受性。

綜上所述，acc基因的過表達可以顯著改善菌株P.acidilactici/pNZ8148-acc在醋酸、乳酸、鹽酸壓力下的耐受性能，這證明acc基因是能夠影響乳酸片球菌多種耐酸性能的關鍵基因。XIAN M等[26]通過acc基因的過表達和敲除發現，該基因在大腸桿菌對鹽（6%NaCl）和堿壓力（pH9）耐受實驗中發揮著重要的正向調控作用。本論文的結果與該基因提高大腸桿菌耐受性能的結果是相一致的，這是acc基因在乳酸菌耐酸性能中發揮重要作用的首次報道。

3 結論

本研究從山西老陳醋釀造過程中醋酸發酵階段篩選出一株對醋酸具有一定耐受性的乳酸片球菌AAF3-3，在培養6 h和24 h后菌液的相對活菌數分別為0.26%和0.001%。該菌株對其他的酸壓力（如乳酸、鹽酸）也表現出耐受性，其中在3%（V/V）乳酸和pH 2.5（鹽酸調節）沖擊120 min后相對活菌數分別為0.000 5%和0.005 9%。以該菌株為對象，通過轉錄水平分析、過表達菌株構建及其耐酸性能發現，基因acc在醋酸、乳酸、鹽酸下轉錄水平均發生明顯上調。乙酰輔酶A羧化酶對菌株在多種酸壓力（醋酸、乳酸、鹽酸）下的耐受性能具有重要的正向調控作用，其中3%（V/V）乳酸沖擊180 min后，過表達菌株的存活數仍能達到104以上，而對照菌株沒有存活。研究成果為乳酸片球菌耐酸機制的研究和耐酸性能的調控提供了重要的基礎數據和理論支持。