正交試驗法優選復方金釵石斛保健酒滲漉工藝

李薪宇，牛曼思，楊 陽，童鈺琴，，楊雪琴，王松濤，稅丕先*

（1.西南醫科大學 藥學院，四川 瀘州 646000；2.瀘州品創科技有限公司，四川 瀘州 646000）

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl.）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，俗稱金釵石、扁金釵、扁黃草、扁草或者黃草，因其形似古代婦女頭上的飾物金釵而得名[1]。金釵石斛是歷版《中國藥典》所記載的名貴中藥材，其具有滋陰清熱、生津益胃、清肝明目和潤肺止咳等功效[2]。金釵石斛中含有豐富的有效成分，主要有生物堿、多糖、黃酮、酚、倍半萜類化合物[3]，其中生物堿類成分石斛堿與多糖是主要發揮藥理活性的基礎物質[4-10]。除此之外，還含有香豆素、甾體、吡喃酮、對羥基苯甲酸、β-谷甾醇、大黃酚類化學成分[11]。現代藥理學研究表明金釵石斛具有保肝、抗氧化、增強免疫力、降血糖血脂、緩解體力疲勞、延緩衰老等顯著功效[12]，目前已經成為國內外保健食品、醫療藥物等領域研究的熱點。

復方金釵石斛保健酒以金釵石斛、人參、黃芪、五味子、茯苓為原料，本方中大部分藥材使用部位為根莖，藥材質地堅韌，細胞壁多糖含量高，在長時間煎煮下，累積溶出率較低，因此非加熱的提取方式能增加有效成分的溶出[13]。目前運用于生產上的非加熱提取方式工藝主要有靜態提取和動態提取，動態提取以滲漉法為代表，靜態提取以冷浸法為代表。滲漉提取可連續操作，藥材細胞內外可持續維持較高濃度差，浸出效率高，是一個動態過程，相當于無數次浸漬，具有有效成分浸出完全、溶劑利用率高、浸出液雜質少等優勢。

本研究采用正交試驗，以石斛堿、總黃酮含量、浸膏得率和感官評價得分為指標進行綜合評價，對復方金釵石斛保健酒的滲漉工藝進行優化，為原料藥材的提取工藝參數提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金釵石斛飲片：采自瀘州合江金釵石斛種植基地；人參、五味子、黃芪、茯苓（經西南醫科大學生藥教研室稅丕先教授鑒定）：瀘州百草堂中藥飲片有限公司；濃香型白酒（52度）：瀘州老窖提供；蘆丁對照品（99.05%，批號：153-18-4）：成都普思生物科技股份有限公司；石斛堿對照品（純度99.70%，批號：111876-201503）、萘對照品（純度99.6%，批號：111673-201604）：中國食品藥品檢定研究所；無水乙醇、冰乙酸、香草醛、亞硝酸鈉、硝酸鋁、高氯酸均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HX-200型中藥粉碎機：浙江省永康市溪岸五金藥具店；UV-I800PC紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；ME204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GC-2010：日本島津公司；10×50 cm滲漉筒：四川聚合化工有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

藥材預處理：將藥材粉碎至65～80目的藥粉，按人參∶金釵石斛∶黃芪∶五味子∶茯苓（9∶6∶6∶2∶2）的比例混合。

浸潤：按照藥材粉∶白酒=1∶9的比例加入不同酒精度的濃香型白酒，在室溫條件下浸潤不同的時間。

滲漉：以不同的流速滲漉至料液比為1∶12。

1.3.2 滲漉工藝優化單因素試驗

影響滲漉的主要因素有滲漉速度、提取酒精度以及滲漉前浸潤時間[14]。因此分別考察滲漉速度（1 mL/（min·kg）、3mL/（min·kg）、5mL/（min·kg）、7mL/（min·kg）、9mL/（min·kg）），提取酒精度（10%vol、38%vol、42%vol、52%vol、68%vol）；浸潤時間（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）對滲漉效果的影響。

1.3.3 滲漉工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇影響滲漉提取的主要因素，滲漉流速（A）、提取酒精度（B）、浸潤時間（C）3個因素作為考察對象，以提取的總黃酮、石斛堿含量、浸膏得率以及感官評價的綜合評價為考察指標，采用L9（34）正交試驗設計，優化滲漉提取工藝。正交試驗因素與水平見表1。

表1 復方金釵石斛保健酒滲漉工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of percolation process of compound Dendrobium nobile health liquor

1.3.4 測定方法

總黃酮含量：按照參考文獻[15-17]的方法進行測定。

石斛堿含量：按照《中國藥典》（2015版）石斛堿檢測方法進行測定。

浸膏得率：精密量取樣品液20mL至質量恒定的蒸發皿中，水浴蒸干后在105℃干燥箱中干燥5 h，于干燥器內冷卻至室溫，待恒重時精密稱定，按照下式計算總固體得率：

感官指標評定方法：參考GB/T 27588—2011《露酒》制定感官評分方法，來評定金釵石斛保健酒的色澤、澄清度、香氣及口感，由3名具有5年以上從事白酒的感官評價和酒的質量檢測人員組成感官評價小組，對不同處理的金釵石斛保健酒樣進行感官評分，記錄結果，以3人評分的平均值為最后評分。

評價方法：本課題研究采用多指標試驗簡易綜合評分法[18-21]，考慮到保健酒中君臣佐使關系以及目標功效，根據主成分權重系數大原則，總黃酮含量（ai）權重系數為0.3，石斛堿含量（bi）權重系數為0.3，浸膏得率（ci）權重系數為0.2，感官評分（di）權重系數為0.2。

式中：xi為綜合評分，ai為總黃酮含量，mg/L；bi為石斛堿含量，mg/L；ci為浸膏得率，%；di為感官評分；S1、S2、S3、S4分別為總黃酮含量、石斛堿含量、浸膏得率、感官評分的標準差。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 滲漉流速的篩選

表2 流速對滲漉工藝的影響Table 2 Effect of flow velocity on percolation process

由表2可知，隨著滲漉速度的增加，滲漉液的綜合評分逐漸降低。原因可能是隨流速增加，新鮮溶劑與藥材的接觸時間減少，溶出成分增加，溶出較多黃酮、生物堿和鞣質等苦澀味物質，感官得分隨之降低。根據綜合評分，選擇低流速滲漉能獲取較好的提取效果，因此選擇滲漉速度為1～5 mL/（min·kg）進行后續正交試驗。

2.1.2提取酒精度的篩選

由表3可知，隨著提取酒精度的增加，總黃酮含量上升，石斛堿先增后減。感官評價方面，酒精度升高生物堿類成分溶出增加，致使澀麻感明顯，感官評價得分下降。因此在酒精度38%vol、42%vol、52%vol時既可保證成分最大限度提取出，又可得到感官較好的浸提液。因此選擇提取酒精度為38%vol、42%vol、52%vol進行后續正交試驗。

表3 提取酒精度對滲漉工藝的影響Table 3 Effect of alcohol content on percolation process

2.1.3 浸潤時間的篩選

表4 前浸潤時間對滲漉工藝的影響Table 4 Effect of soaking time on percolation process

由表4可知，滲漉提取法在正式滲漉前予以適當的浸泡，吸收溶媒使之組織浸潤膨脹，將有利于溶質更好地交換。隨浸潤時間延長，溶劑進入藥材組織交換出的成分越多，本試驗中浸潤時間≥24 h更有利于滲漉效率，功效成分及浸膏得率均呈增加趨勢。浸潤時白酒中各類成分與藥材充分反應，使藥香酒香復合協調，隨浸潤時間增加感官評價增加。因此選擇浸潤時間18h、24h、30h進行后續正交試驗。

2.2 正交試驗

表5 復方金釵石斛保健酒滲漉工藝優化正交試驗結果與分析Table 5 Results of orthogonal test for optimization of percolation process of compound Dendrobium nobile health liquor

由表5可知，影響滲漉的各因素次序為C（浸潤時間）＞A（滲漉流速）＞B（提取酒精度），最優水平組合為A1B3C1，綜合考慮實際生產的時間成本的影響，將最優工藝調整為A3B3C1，即復方浸泡于9倍體積的52%vol白酒中18 h，以5 mL·（min·kg）-1流速滲漉。

2.3 最佳工藝穩定性試驗結果

為了驗證最佳工藝的準確性，在最佳滲漉條件下進行驗證試驗所得滲漉液石斛堿、總黃酮含量、浸膏得率及感官評價分別為183.37 mg/L，219.74 mg/L，24.81%，75分。

3 結論

最終得出的最佳滲漉提取工藝為人參、金釵石斛、黃芪、茯苓、五味子打粉，過65～80目篩，加入9倍體積的52%vol白酒浸潤18 h，以5 mL/（min·kg）流速滲漉。所得滲漉液石斛堿、總黃酮含量、浸膏得率及感官評價分別為183.367 mg/L，219.742 mg/L，24.810%，75分。此方法可作為金釵石斛保健酒的最佳滲漉工藝。