QuEChERS-HPLC-MS/MS測定蔬菜中29種農藥殘留

楊 明，伊 鋆，許 晴，董秋花，李首道，陳 丹，王夢穎，管卓龍，何麗姍，盧躍鵬，江小明，涂鳳琴*，宮智勇

（1.武漢食品化妝品檢驗所，湖北 武漢 430012；2.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北 武漢 430030）

我國農業生產中登記的農藥達1 000多種。蔬菜種植過程中農藥使用不合理、禁限用農藥濫用等現象時有發生，導致農藥殘留問題日益突出，給人們健康帶來極大的危害[1]。因此，農藥多殘留的分析監測對于指導農藥的科學合理使用，保障食品安全具有重要意義。

目前，蔬菜農藥多殘留的分析方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[2-4]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-7]、氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8-10]和液相色譜-串聯質譜聯用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[11-13]等。LC-MS/MS法因其具有選擇性高、靈敏度高、適用范圍廣等特性而被廣泛應用于農藥多殘留檢測領域。在前處理技術方面，傳統的前處理方法較為繁瑣復雜，難以滿足現代分析檢測的要求。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）技術將提取和凈化同步進行的最新前處理技術，吸附劑選擇是QuEChERS技術的關鍵環節之一，針對不同的樣品，QuEChERS方法中不同的吸附劑能夠產生不同的凈化效果，不同的吸附劑組合也會帶來不同的結果，由于其具有操作簡單、便捷高效、溶劑用量小等特點，已被廣泛應用于食品中農藥殘留的分析檢測[14-18]。乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）等是QuEChERS前處理技術的常用吸附劑，可有效去除基質中的有機酸、糖類和色素等多種組分。GCB具有較好的除色素效果，但對多菌靈、噻菌靈等平面結構農藥具有較強的吸附性，因此本實驗不選用該吸附劑。

該研究采用QuEChERS前處理技術，結合高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）的高選擇性、高靈敏度和強抗干擾能力等特點[19]，建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS快速測定蔬菜中29種農藥殘留的分析方法。該方法操作簡便、靈敏度高、重現性好、分析速度快，適用于蔬菜中農藥多殘留的同時檢測，為蔬菜中農藥殘留的風險監測提供了技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

29種農藥標準品（純度91.5%～99.7%）：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈、乙酸銨（均為色譜純）：德國Merck公司；甲酸（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）：上海安譜科學儀器公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

菠菜、小白菜、黃瓜和韭菜等10種蔬菜樣品從市場上隨機抽取。

1.2 儀器與設備

SCIEX4500QTRAP串聯質譜儀（配有可用于電噴霧電離的TurboV離子源））：美國ABSCIEX公司；LC30A液相色譜儀：日本島津公司；AllegraX-15RCentrifuge離心機：美國貝克曼庫爾特公司；Vortex-Genie2渦旋振蕩器：美國Scientific Industries公司；PM5-2000TL超聲波清洗器：普律瑪儀器公司；Milli-Q超純水系統：美國Millipore公司；ME204/02電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1標準溶液配制

分別準確稱取適量的農藥標準品，用甲醇溶解，配制質量濃度為10μg/mL的標準儲備液，于-18℃保存。臨用時，移取適量的標準儲備液用空白樣品基質提取液配制系列濃度的基質匹配標準工作溶液，現用現配。

1.3.2樣品前處理

準確稱取勻漿的樣品5.0g，置于50mL聚丙烯離心管中，加入10 mL乙睛和3 g NaCl，渦旋混勻，超聲提取30 min，以4750r/min轉速離心5min，取上清液待凈化。取2mL上清液置于含有25 mg C18+50 mg PSA吸附劑的離心管中，渦旋30 s，靜置后取上清液過0.22 μm濾膜后，供HPLC-MS/MS測定。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫：40℃；進樣量：2μL；流動相：A--5mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水；B--5mmol/L乙酸銨-甲醇；梯度洗脫程序：0～1.0min，5.0%B；1.0～3.5 min，5.0%～30.0%B；3.5～6.5 min，30.0%～90.0%B；6.5～9.5 min，90.0%B；9.5～9.6 min，90.0%～5.0%B；9.6～12 min，5.0%B。

（2）質譜條件

電離源：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）正離子模式；掃描方式：多反應監測模式；電噴霧電壓：4500V；霧化氣：50.0 psi；氣簾氣壓力：30 psi；碰撞氣體：Medium；輔助氣流速：50psi；離子源溫度：450℃。

1.3.4 條件優化

（1）色譜條件的優化

選擇Waters XBridgeC18色譜柱（150mm×2.1mm，5μm）對29種農藥進行分離分析，并比較了29種農藥在乙腈-水與甲醇-水流動相體系中的色譜分離效果，進一步考察不同含量的流動相對分離效果的影響。

（2）質譜條件的優化

利用針泵進樣將29種目標化合物注入質譜儀中優化質譜參數。首先選擇全掃描模式確定29種化合物的母離子。結果表明29種化合物在正離子（ESI+）掃描模式下的質譜響應較高。對29種化合物進行二級碎片離子掃描，選擇響應較高、干擾小的兩個碎片離子用于定性定量分析，其中響應最高的碎片離子用于定量分析。最后優化各目標化合物的去簇電壓、碰撞能量等質譜參數。

（3）提取溶劑的優化

該實驗以標準添加樣品對提取溶劑的種類進行了考察，比較了甲醇、0.5%甲酸甲醇、1.0%甲酸甲醇、乙腈、0.5%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈6種溶劑的提取效果。

（4）凈化方法的選擇

蔬菜基質較為復雜，含色素、有機酸、維生素、蛋白質等多種成分[20]，在提取過程中這些物質可能會和目標物一起被提取出來，這些共提物不僅干擾目標物的檢測，而且可能會損害色譜柱，污染離子源，因此有必要進行凈化處理。以菠菜樣品基質為例，各凈化方法對回收率的影響。該實驗考察了25mgC18+25mgPSA、50mgC18+25mg PSA、100 mg C18+25 mg PSA、25 mg C18+50 mg PSA、50mgC18+50mgPSA、100mgC18+50mgPSA、25mgC18+100mg PSA、50 mg C18+100 mg PSA、100 mg C18+100 mg PSA這九種不同含量的凈化劑組合對29種農藥回收率的影響。

2 結果與分析

2.1 條件優化結果

2.1.1 色譜條件優化結果

結果表明目標化合物在5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水和5 mmol/L乙酸銨-甲醇組成的流動相中分離效率高、保留較好且質譜響應高。因此，該實驗采用5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水和5 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相。29種農藥在MRM模式下的離子色譜圖見圖1。結果表明，29種目標化合物在11 min內可實現良好分離，峰形對稱。

圖1 29種農藥在多反應監測模式下的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatographs of 29 pesticides residues with multiple reaction monitoring mode

2.1.2 質譜條件的優化結果

29種農藥的母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量等重要質譜參數如表1所示，均為29種農藥的最佳質譜參數。

表1 29種農藥的母離子、子離子等重要質譜參數Table 1 Precursor ions,products ions,and other important MS parameters of 29 pesticides residues

續表

2.1.3 提取溶劑的優化結果

不同提取溶劑中29種農藥的提取回收率如圖2所示。由圖2可知，6種提取溶劑的平均回收率分別為55.93%、55.30%、56.06%、86.91%、77.98%和77.28%，這表明采用純乙腈的提取效果優于其他5種提取試劑，且滿足實驗要求。

圖2 不同提取溶劑對蔬菜中29種農藥的提取效率Fig.2 Extraction efficiencies of different extraction solvents for 29 pesticides residues in vegetables

2.1.4 凈化方法的優化結果

不同凈化劑對蔬菜中農藥回收率的影響結果見圖3。結果表明，25 mg C18+50 mg PSA凈化效果最佳，對29種農藥的平均回收率為90.76%，而其它8種吸附劑對29種農藥的平均回收率均低于90%，且在霜霉威的回收率方面，25mg C18+50 mg PSA為72.07%，而50 mg C18+25 mg PSA、50 mg C18+50mgPSA、100mgC18+50mgPSA、25mgC18+100mg PSA、50 mg C18+100 mg PSA、100 mg C18+100 mg PSA均低于70%；啶酰菌胺的回收率方面25 mg C18+50 mg PSA為72.07%，而25 mg C18+25 mg PSA、50 mg C18+25 mg PSA、100 mg C18+25 mg PSA、50 mg C18+50 mg PSA也均低于68%。故選用25 mg C18+50 mg PSA吸附劑組合作為最優凈化方案。

圖3 不同凈化劑對蔬菜中29種農藥回收率的影響Fig.3 Effect of different purificants on the recoveries of 29 pesticides residues in vegetables

2.2 基質效應

基質效應（matrix effect，ME）指目標分析物以外的其他組分對分析信號引起的增強或抑制現象，通常以基質標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值來進行評價。若ME在0.80～1.20之間，基質效應可以忽略。反之，基質效應不可忽略[21]。本實驗用菠菜、小白菜黃瓜和韭菜等10種蔬菜的空白基質提取液與純溶劑分別配制系列濃度的混合標準工作溶液，通過比較標準曲線的斜率來評價基質效應。結果表明：以菠菜為例，除了氟吡甲禾靈存在一定的基質增強效應（ME＞1.20），啶酰菌胺存在一定基質抑制效應（ME＜0.80）外，其他農藥的基質效應均在0.80～1.20之間。具體結果如表2所示。因此，該實驗采用基質匹配標準工作溶液作校準曲線來降低基質效應對測定結果的影響。

表2 29種農藥的基質效應Table 2 Matrix effect of 29 pesticides

2.3 線性關系與定量限

用空白基質提取液配制系列濃度的29種農藥混合標準工作溶液，以峰面積（y）為縱坐標，質量濃度（x）為橫坐標繪制基質標準工作曲線。結果表明：在質量濃度范圍內，霜霉威的響應值與其質量濃度線性關系較好，相關系數（R）為0.995 8，其他28種農藥的響應值與其質量濃度均呈現良好的線性關系，相關系數（R）均大于0.999 0。以10倍信噪比（S/N）計算定量限（limit of quantitation，LOQ），該方法29種農藥的定量限在0.40～8.00 μg/kg之間。選取陰性樣品添加三個濃度水平（LOQ、4LOQ、20LOQ）的混合標準溶液，每個水平做6次平行實驗，計算回收率和精密度，結果見表3。由表3可知，29種農藥的加標回收率在64.62%～123.55%之間，相對標準偏差（rlative sandard deviation，RSD）在0.7%～14.3%之間，表明方法回收率高、精密度高，能夠滿足蔬菜中農藥殘留監測的要求。

表3 29種農藥的線性范圍、線性方程、定量限、加標回收率及相對標準偏差Table 3 Linear ranges,linear equations,limits of quantification,recoveries and relative standard deviation of 29 pesticides

2.4 實際樣品測定

利用該實驗建立的方法對市場上購買的50份蔬菜樣品進行檢測，共檢出20份陽性樣品，小白菜、黃瓜、韭菜等樣品中農藥殘留的檢出率較高，檢出頻率較高的農藥為多菌靈、啶蟲脒、噠螨靈、烯酰嗎啉、辛硫磷等殺菌劑和殺蟲劑。該方法與國標方法的部分測定結果見表4。

表4 部分陽性樣品農殘檢測結果Table 4 Determination results of pesticides residues of practical positive samples

由表4可知，小白菜中的啶蟲脒含量為2.04mg/kg，韭菜中的多菌靈含量為2.25 mg/kg，均超過了GB 2763—2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》規定的最大殘留限量。該實驗同時采用GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品殘留量的測定》標準方法對上述陽性樣品進行測定來驗證方法的準確性，其結果與本方法測得值相吻合。

3 結論

該實驗以蔬菜為研究對象，建立了QuEChERS-HPLCMS/MS快速測定29種農藥的分析方法。分別對樣品前處理方法、色譜條件、質譜條件進行了優化，采用多反應監測模式檢測，基質匹配標準溶液外標法定量，能夠同時完成蔬菜中29種農藥的定性和定量分析。該方法簡單快速、靈敏可靠，為農藥多殘留的測定節約了分析時間，可廣泛應用于蔬菜中29種農藥的測定。