香格里拉本土釀酒酵母冰酒發酵產香特征分析

秦偉帥，張岳勛，張 娜，張 蕾

（1.泰山學院 生物與釀酒工程學院 葡萄酒微生物重點實驗室，山東 泰安 271018；2.蓬萊市葡萄與葡萄酒產業發展服務中心，山東 蓬萊 265600）

葡萄酒品質受葡萄品種和發酵過程中微生物種群的影響，而香氣物質是決定葡萄酒品質的重要因素之一。葡萄酒香氣由多種揮發性化合物構成，包括醇類、酯類、酸類、萜烯類等物質，主要來源于葡萄品種、發酵過程和后期陳釀[1]。這些揮發性化合物因其極性、揮發性和濃度的不同，從而使葡萄酒具有不同的風味獨特性[2]。香格里拉產區赤霞珠冰酒是在自然溫度降到-8℃以下時（有的產酒規規定-7℃），對冰葡萄進行采摘，以冰凍狀態進行壓榨釀制而成。所釀酒通常具有蜂蜜、成熟的蜜瓜、菠蘿、玫瑰以及葡萄干等風味，其風味的形成與產區氣候環境、發酵工藝條件關系密切。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在發酵過程中產生的香氣物質對葡萄酒風味有重要影響，是葡萄酒揮發性化合物的重要組分[3]。由酵母發酵過程中產生的揮發性化合物主要包括高級醇、中鏈和長鏈脂肪酸、脂肪酸乙酯、乙基酯、醛類等物質[4]。酵母產香能力不僅受菌種影響，而且與產糖苷酶性能強的菌株存在一定聯系[5]。不同酵母發酵同一葡萄酒所產生的風味物質差異明顯[6]，主要由于酵母釋放葡萄品種風味前體和從頭合成的能力不同[7]。相關研究發現，本土酵母能增加葡萄酒的口感復雜性和圓潤度，更好的適應當地氣候和發酵環境，保證葡萄酒發酵的順利進行[8]。因此，篩選合適的本土酵母對葡萄酒生產至關重要。

本研究采用4株香格里拉本土酵母（CZ10、CZ11、BZL10、BZL12）與商業酵母DV10發酵赤霞珠冰酒，通過頂空-固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HP-SPME）和氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術檢測分析冰酒的揮發性香氣物質，并利用感官評定比較其感官品質優劣，旨在探究香格里拉本土酵母和進口商業干酵母發酵赤霞珠冰酒的香氣物質和感官差異性，為香格里拉產區特色冰酒的挖掘和適宜冰酒釀造的酵母菌株選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和原料

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株CZ10、CZ11、BZL10、BZL12：均篩選于香格里拉葡萄酒產區梅里冰酒莊葡萄園（泰山學院微生物菌種保藏中心）；商業酵母菌株DV10：法國拉曼公司。

赤霞珠葡萄：選自云南香格里拉太陽魂酒莊產業有限公司梅里冰酒莊。

1.1.2 化學試劑

乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、2-苯乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸、己酸、辛酸和癸酸（純度均＞98%）：美國Sigma公司；內標物4-甲基-2-戊醇（純度＞98%）：美國Aldrich公司；氯化鈉（分析純）：國藥化學試劑有限公司；果膠酶（酶活4 150 U/g）：法國拉曼公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，pH自然，在121℃條件下滅菌15 min。固體YPD培養基添加2%瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

QP2010Plus氣質聯用儀：日本島津公司；5417C型離心機：德國Eppendorf公司；MP220K pH計：瑞士METTLER TOLEDO公司；手動SPME進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 赤霞珠冰酒工藝流程及操作要點

成熟葡萄→除梗破碎→低溫浸漬→酒精發酵→皮渣分離→自然澄清→陳釀→過濾→灌裝→包裝

操作要點：葡萄原料含糖量達到350 g/L時進行采摘，除梗破碎，添加總二氧化硫達到30 mg/L；如桶浸漬，浸漬溫度5℃，浸漬時間120 h；果膠酶添加量30 mg/L；接種酵母（取試管斜面酵母于三角瓶中37℃活化30 min，轉接到發酵醪中），接種量1×107個/mL；進行發酵（發酵溫度12℃）；酒精發酵期間每12 h取樣檢測酒精度，每次3個重復；酒精度達到13%vol時，分離皮渣，生葡萄酒轉入新罐，添加總二氧化硫60 mg/L；低溫2℃冷凍處理15 d；分離酒腳，澄清酒轉入新罐，檢測游離二氧化硫，保證其含量20 mg/L；葡萄酒密封陳釀（溫度13℃），利用惰性氣體（氮氣）封罐，持續到來年10月發酵季節；過濾灌裝得冰酒。

1.3.2 理化指標測定

酒樣的pH、總酸、揮發酸、總糖和酒精度測定參照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的pH計法、酒精計法、總糖直接滴定法、總酸測定指示劑法、揮發酸測定方法。

1.3.3揮發性香氣物質的測定[9-10]

冰酒香氣物質測定采用HS-SPME-GC-MS法。揮發性香氣物質的提取：萃取頭放入進樣口280℃老化30 min。在20 mL頂空瓶中，加入8 mL葡萄酒，2 g NaCl和20 μL內標物（4-甲基-2-戊醇，質量濃度為2 g/L）。放置于45℃的可加熱磁力攪拌器上，預熱10 min。將老化好的萃取針插入頂空瓶，45℃進行萃取，萃取50 min后插入GC-MS進樣口，250℃解吸10 min。

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進樣口溫度250℃；升溫程序：40℃下保持2 min，然后以1℃/min的速度升到45℃，保持2 min，3℃/min的速度升到84℃，保持2 min，5℃/min的速度升到230℃，保持5 min，載氣為氦氣（He）。平均線速度為25 cm/s；不分流進樣。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；檢測器溫度250℃；質量掃描范圍30～400 m/z。

定性定量分析：分析結果美國國家標準技術研究（national institute of standards and technology，NIST）08和WILEY7譜庫進行初步檢索及資料分析，再結合文獻進行人工譜圖解析，確認香氣物質的各個化學成分。采用內標法進行定量。

1.3.4 感官評價

不同酵母發酵的酒樣放在通風良好、無任何氣味的房間內，分別由專業人員采用定量描述分析法（quantitative descriptive analysis，QDA）進行酒樣感官的定性和定量評價[11]，整體評價滿分為100分，具體評價標準見表1。

表1 冰酒感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standard of ice wine

續表

1.3.5 統計分析

數據采用SPSS 19.0軟件進行分析。實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 赤霞珠葡萄冰酒理化指標分析

對釀酒酵母菌株CZ10、CZ11、BZL10、BZL12及商業酵母DV10發酵赤霞珠冰酒樣品進行理化指標測定，結果見表2。由表2可知，各酵母發酵酒樣的基本理化指標差別不大，均符合相關國標要求。本土酵母所發酵酒樣較商業酵母DV10具有較低的揮發酸和總酸含量，其中本土酵母BZL10揮發酸含量最低，為0.54 g/L；CZ10的總酸含量最低，為6.3 g/L。總糖測定結果發現，本土酵母發酵酒樣的總糖含量整體較高，其中CZ10總糖含量為126.7 g/L，BZL12為121.82g/L，均高于商業酵母DV10發酵酒樣總糖含量110g/L。

表2 不同酵母發酵冰酒理化指標測定結果Table 2 Determination results of physicochemical indexes of ice wines fermented by different yeasts

2.2 赤霞珠葡萄冰酒發酵動力學分析

發酵醪接種酵母后進行糖度的測定，結果見圖1。由圖1可知，本土酵母BZL12接種2 d后糖度開始下降，起酵迅速；商業酵母DV10在接種4 d后起酵；酵母BZL10在第5天起酵；酵母CZ10、CZ11在第6天起酵。當酒精度接近13%vol的終止發酵，此時酵母BZL12糖度為7.8°Be，發酵周期最短，共35 d；其次是菌株BZL10糖度為7.1°Be，發酵周期共37 d；酵母CZ10和CZ11糖度分別為8 °Be和7.5 °Be，發酵周期分別為45 d和41 d；酵母DV10發酵周期最長，為47 d，糖度為7.2°Be。因此，本土釀酒酵母發酵周期都較短，可能與本土酵母更加適應當地的發酵環境有關系，其中釀酒酵母BZL12表現最佳（發酵周期35 d）。

圖1 五株酵母的發酵動力學曲線Fig.1 Fermentation kinetics curves of five yeasts

2.3 赤霞珠葡萄冰酒揮發性化合物分析

試驗對五株酵母發酵冰酒樣進行香氣物質的定性定量分析，檢測結果見表3。由表3可知，五種釀酒酵母發酵赤霞珠葡萄冰酒共檢測到67種揮發性化合物，主要包括醇類、酯類、酸類、酮類、萜烯類。其中酵母BZL12檢測到62種香氣物質，種類最多，含量最高（490.02 mg/L）；酵母BZL10次之，檢測到60種香氣物質，含量474.06 mg/L；酵母CZ11檢測到59種香氣物質，含量434.80 mg/L；酵母DV10和CZ10種類較少，分別檢測到56和54種香氣物質，含量分別為469.05 mg/L、410.67 mg/L。

酵母BZL12酯類物質含量最高，為145.31 mg/L，酵母CZ10、CZ11及BZL10酯類物質含量分別為78.24 mg/L、96.58 mg/L及130.22 mg/L，均比酵母DV10酯類物質含量（125.14 mg/L）低。酯對葡萄酒香氣中的花香和果香貢獻非常大[12-13]。其中，乙酸乙酯能產生愉悅的、甜的水果香，己酸乙酯產生果香或蘋果香，辛酸乙酯產生菠蘿、梨的果香，癸酸乙酯產生花香，月桂酸乙酯與果香有關，乙酸異戊酯則產生香蕉味，這些酯類是酵母發酵酒中的主要酯類[14]。

酵母BZL12、CZ10、CZ11及BZL10醇類物質含量在323.80～337.66 mg/L之間，均與酵母DV10醇類物質含量（335.22 mg/L）差別不大。正丙醇、異丁醇、異戊醇和2-苯乙醇是酵母合成的主要高級醇[15]，其中，異戊醇是主要的高級醇，5株酵母異戊醇含量229.68～236.85 mg/L，差異不大。

酵母BZL12、CZ10、CZ11及BZL10萜烯類物質含量在0.11～0.18mg/L之間，均與酵母DV10醇類物質含量（0.16mg/L）差別不大。

酵母CZ10酮類物質含量最高，為2.75mg/L，酵母CZ11、BZL10及BZL12酮類物質含量分別為1.82 mg/L、1.64 mg/L及1.73 mg/L，均比酵母DV10酮類物質含量（2.28 mg/L）低。

表3 不同酵母菌株發酵冰酒揮發性香氣化合物Table 3 Volatile aroma compounds of ice wine fermented by different yeast strains mg/L

續表

酵母BZL12酸類物質含量最高，為490.02 mg/L，其次是酵母BZL10（474.06 mg/L），酵母CZ10、CZ11酸類物質含量分別為410.67 mg/L、434.80 mg/L，均比酵母DV10酸類物質含量（469.05 mg/L）低。

綜上所述，酵母BZL12發酵冰酒揮發性香氣化合物檢測到香氣物質種類最多，含量最高，適合作為冰酒制備的優良菌株。

2.4 赤霞珠葡萄冰酒的感官分析

對5種酵母發酵的赤霞珠葡萄冰酒樣品進行感官評定，結果見圖2。由圖2可知，各酵母在相同的感官特性上所表達的每種特性的強度不同。整體感官評價得分由高到低依次為：BZL12（95分）、CZ11（90分）、BZL10（80分）、CZ10（74分）、DV10（56分）；酵母BZL12發酵的酒樣花香、黑色漿果香、蜂蜜香比較明顯，具有較低的生青味，可能與酵母合成大量的酯類有關[16]；CZ11發酵的酒樣堅果香、奶油香比較明顯；CZ10和DV10菌株發酵酒樣的生青味較大；而菌株BZL10具有較突出的奶油香。酵母菌株影響葡萄酒的香氣[17-20]。不同酵母發酵赤霞珠葡萄酒香氣物質存在差異性[18]。

圖2 各酵母菌株的二次判別分析數據蜘蛛網形圖Fig.2 Spider web chart of quadratic discriminant analysis data of yeast strains

3 結論

本土酵母BZL12發酵冰酒生成的香氣物質種類最為豐富，香氣物質含量最高，酯類和醇類總量均高于商業酵母DV10。感官分析結果表明，酵母BZL12發酵葡萄酒的整體評價最高，理化指標滿足相關國標要求。在香格里拉產區冰葡萄酒釀造中，可以利用本土酵母BZL12替代商業酵母DV10增加冰酒香氣的復雜性。此外，不同本土酵母具有生產不同風味特征葡萄酒的應用潛力，可以根據酵母的發酵性能、產香特性等釀造特定類型的葡萄酒。還可以用不同類型酵母按一定比例混合發酵，根據市場需求生產不同風味葡萄酒。