左氧氟沙星與莫西沙星對結核分枝桿菌交叉耐藥性的體外研究

(太原市第四人民醫院，山西 太原 030053)

2018年世界衛生組織全球結核病年度報告提出，2017年中國結核病病死率0.04(0.04～0.05)，MDR-TB/RR-TB發病人數為7.3(5.5～9.4)萬人，新發肺結核患者中MDR-TB/RR-TB為7.1%(5.6～8.7)，復治結核患者中MDR-TB/RR-TB為24%(20～28)[1]。氟喹諾酮類，尤其是左氧氟沙星和莫西沙星在MDR-TB/RR-TB的治療中起到了重要作用，WHO也將氟喹諾酮類藥物是治療耐藥結核病的核心藥物[2，3]。隨著氟喹諾酮類藥物使用的不斷增加，臨床上的不規范用藥，已出現對左氧氟沙星和莫西沙星耐藥的菌株，這對MDR-TB/RR-TB的治療是非常嚴峻的挑戰。目前關于左氧氟沙星與莫西沙星的交叉耐藥性暫無指導意見。有文獻表明，LVF與MFX為非完全交叉耐藥，對LVF低濃度耐藥的患者可考慮用MFX代替LVF,高濃度耐藥則避免使用氟喹諾酮類藥物。本研究以比例法藥敏為依據，研究左氧氟沙星與莫西沙星的交叉耐藥性，為臨床是否使用MFX代替LVF用于MDR-TB/RR-TB的治療方案提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集太原市第四人民醫院2016年8月～2018年12月住院肺結核患者經痰羅氏結核分枝桿菌培養及菌型鑒定確診的病例，選取其中行羅氏結核菌藥敏的痰標本319例。319例標本中，男171例，女148例。年齡分布18～79歲。

1.2 方法

1.2.1 羅氏結核菌培養 患者痰標本經N-乙酰-L-半胱氨酸=氫氧化鈉(NAC-NaOH)去污，離心后，棄去上清液，采用改良固體培養基對沉淀物進行平行接種，接種后第3天和第7天觀察培養情況，此后每周觀察一次，直至第8周。操作過程遵照《分枝桿菌分離培養操作程序及質量保證手冊》中的標準化操作程序執行。

1.2.2 羅氏比例法藥敏 qu采用臨界藥物濃度和臨界耐藥菌比例兩個切值來限定有臨床意義的耐藥性。取培養基上生長良好的臨床分離株，研磨 分散 ，用生理鹽水稀釋成1 mg/mL的菌懸液，逐步稀釋成將菌量分別為10～2 mg/mL和10～5 cfu /管(相差100倍)接種于含藥和無藥培養基斜面上，培養后4周后讀取含藥和無藥斜面上菌落數，計算耐藥百分比。耐藥百分比=含藥培養基上生長的菌落數/對照培養基上生長的菌落數×100%。若耐藥百分比大于等于1%，則認為受試菌對抗結核藥耐藥。操作過程遵照《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗操作程序及質量保證手冊》中的標準化操作程序執行。

1.2.3 菌型鑒定 結核分支桿菌復合群具有生長緩慢(通常3周，有時達6周)，不產生色素，在羅氏培養基斜面上菌落具有粗糙，皺褶，淡黃色和干燥的典型的特點。在PNB羅氏培養基上，接種104 cfu/mL分離培養物，35～37℃培養4周后觀察生長情況，和對照培養基相比有菌落生長者為非結核分支桿菌，未生長菌落或有幾個菌落生長為結核分支桿菌復合群。

2 結果

319例肺結核病例中，左氧氟沙星耐藥為38例，耐藥率為11.91%(38/319)。莫西沙星耐藥16例，耐藥率為5.02%(16/319)，莫西沙星的耐藥率低于左氧氟沙星。左氧氟沙星敏感菌株中100%(218/218)對莫西沙星敏感。左氧氟沙星耐藥菌株中42.1%(16/38)對莫西沙星耐藥，57.9%(22/38)對莫西沙星敏感。莫西沙星耐藥菌株中100%(16/16)對左氧氟沙星耐藥。見表1。

表1 左氧氟沙星與莫西沙星耐藥情況 例

以上結果提示：左氧氟沙星與莫西沙星對結核分枝桿菌存在單向交叉耐藥。

3 討論

隨著研究的不斷深入，已有足夠的證據表明氟喹諾酮類藥物(FQs)對結核分枝桿菌有很強的殺菌與滅菌能力，2016年世界衛生組織將氟喹諾酮類藥物中的左氧氟沙星 莫西沙星 加替沙星列為治療耐多藥結核病的A組核心藥物[3]，足見該類藥物在結核病治療中的作用。FQs類藥物的作用機制為作用于MTB的脫氧核糖核酸(DNA)旋轉酶(拓撲異構酶)，阻止DNA的復制，轉錄而發揮抗MTB的作用[2]。莫西沙星是第四代超廣譜氟喹諾酮類抗生素，它的結構特點是在FQs分子結構的第8位碳原子帶入甲氧基[4]。左氧氟沙星與莫西沙星的抗MTB的MIC分別為0.25～1.01 mg/L，0.125～0.5mg/L，Mfx的體外抗菌活性是Lfx的2倍[5]。而2015年中國耐藥結核病指南提出，如左氧氟沙星(第三代氟喹諾酮類藥物)耐藥時第四代氟喹諾酮類藥物(莫西沙星，加替沙星)是否有效尚不能肯定，這時應用第四代氟喹諾酮類藥物不一定有效。本實驗研究表明，以比例法藥敏為金標準，在山西省，左氧氟沙星與莫西沙星存在單向交叉耐藥，對左氧氟沙星耐藥的結核分枝桿菌對莫西沙星可能敏感，對莫西沙星耐藥的患者對左氧氟沙星均耐藥。值得注意的是，WHO在“結核病耐藥性監測指南第四版”中將莫西沙星和左氧氟沙星的耐藥界限定為MIC=0.25 mg/L和MIC=2.0 mg/L，這可能將不少對莫西沙星敏感的菌株界定為耐藥株[5]。這種劃分的合理性有待進一步驗證。

氟喹諾酮類藥物耐藥多發生在gyrA和gyrB這兩個基因上，gyrB基因突變發生率較gyrA基因低的多，gyrB突變通常與低濃度氟喹諾酮類藥物耐藥相關[6]。gyrA基因突變是我國人群對氟喹諾酮類藥物耐藥菌株最主要的耐藥機制,不同gyrA突變類型導致對氟喹諾酮類藥物不同的耐藥水平。gyrA基因密碼子90、91、94是最常見突變位點，其中94編碼的天冬氨酸為丙氨酸、天冬酰胺、組氨酸所置換，占耐藥突變株的42%。有研究結果顯示，密碼子94位點突變往往伴有更高的MIC值，即產生了高濃度耐藥；而密碼子91位點突變伴有低濃度耐藥[7]。第94位點突變類型較多,導致不同的耐藥水平。有研究表明，第94位點天冬氨酸突變為天冬酰胺時左氧氟沙星和莫西沙星的高水平耐藥比例分別為30.0%(3/10)和100.0%(10/10);94位點天冬氨酸突變為半胱氨酸的菌株同時表現為對2種氟喹諾酮類藥物的高水平耐藥;而第94位點突變為丙氨酸時與低水平氟喹諾酮類藥物耐藥有關，對左氧氟沙星和莫西沙星低水平耐藥率分別為100.0%(12/12)和58.3%(7/12)[8]。該研究顯示，左氧氟沙星與莫西沙星為不完全交叉耐藥。

也有研究顯示，在復治肺結核患者結核分枝桿菌臨床分離株對氟喹諾酮類藥物的體外交叉耐藥性表明，使用最低抑菌濃度法檢測結核分枝桿菌對左氧氟沙星，莫西沙星的敏感性，對lfx耐藥菌株中8.1%(3/37)同時耐mfx，3對mfx耐藥的菌株同時耐lfx。而使用MGIT960檢測結果顯示，對lfx耐藥菌株中100.0%(21/21)耐mfx，耐mfx的菌株中47.7%(21/44)耐lfx[9]。研究提示，復治肺結核患者臨床分離株LFX與mfx之間存正向交叉耐藥率較低，臨床治療最好結合MIC值檢測結果而擇優用藥[10]。

本研究提示以比例法藥敏為參考標準，左氧氟沙星與莫西沙星對結核分枝桿菌存在單向交叉耐藥，對左氧氟沙星耐藥的結核分枝桿菌對莫西沙星大部分仍然敏感，為選擇氟喹諾酮類藥物治療耐藥結核病方案提供參考了依據，基于目前各個實驗室研究氟喹諾酮類藥物對結核分枝桿菌的耐藥性方法不同，研究結果不盡相同，還需對左氧氟沙星與莫西沙星交叉耐藥性做進一步試驗研究。

結核病是危害人類生命健康的主要傳染性疾病之一，中國是結核病與耐藥結核病高危國家之一，鑒于氟喹諾酮類藥物之間的交叉耐藥性，左氧氟沙星與莫西沙星交叉耐藥性還需進一步試驗研究。