本土戴爾有孢圓酵母在葡萄酒釀造中的應(yīng)用潛力

楊詩(shī)妮，葉冬青*，賈紅帥，張文靜，宋育陽(yáng)，劉延琳*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

葡萄酒發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中酵母菌起主要作用。在工業(yè)生產(chǎn)中，大多數(shù)的釀酒師傾向于添加商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）完成發(fā)酵過(guò)程，以降低發(fā)酵風(fēng)險(xiǎn)。然而，傳統(tǒng)的自然發(fā)酵并不是由單一S. cerevisiae完成的，非釀酒酵母群體在自然發(fā)酵前期占據(jù)的比例遠(yuǎn)超過(guò)S. cerevisiae。早期研究認(rèn)為非釀酒酵母是葡萄酒中的敗壞菌種。近年來(lái)，隨著研究者對(duì)非釀酒酵母的深入研究，非釀酒酵母的潛在應(yīng)用價(jià)值受到越來(lái)越多的關(guān)注，其中采用非釀酒酵母和S. cerevisiae混合發(fā)酵策略更是提升葡萄酒質(zhì)量、突出葡萄酒典型性風(fēng)格的重要手段。

戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii），也是軟假絲酵母（Candida colliculosa）的無(wú)性型，廣泛分布于葡萄園、葡萄表皮和釀酒環(huán)境中，是葡萄表面天然微生物群的典型代表。早在1954年，相關(guān)研究指明該菌具有高的乙醇發(fā)酵力，可作為發(fā)酵的啟動(dòng)菌。隨后，CHR Hansen、Lallemand和Laffort公司紛紛推出了商業(yè)T. delbrueckii[1]。相對(duì)于S. cerevisiae，T. delbrueckii具有低產(chǎn)乙醇的特性，其產(chǎn)乙醇能力為8%～14%[2]，相關(guān)研究表明其在低醇葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中具有積極作用[3]。T. delbrueckii在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生較少的乙酸、乙酸乙酯、乙醛等，并可以緩慢地發(fā)酵大量的糖，產(chǎn)生較多甘油[4-5]。另外，T. delbrueckii具有良好的環(huán)境耐受力，尤其是高糖耐受力。劉燦珍等[6]對(duì)T. delbrueckii耐受性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示T. delbrueckii能夠耐受18%乙醇、400 mg/L SO2和500 g/L糖；劇檸等[7]從枸杞果酒中分離獲得1 株T. delbrueckiiGB-1在100～400 g/L糖、100～250 mg/L SO2的培養(yǎng)基中，24 h內(nèi)可到達(dá)生長(zhǎng)旺盛期；Bely等[4]將T. delbruecki運(yùn)用于貴腐酒（原料含糖量350～450 g/L）釀造，不但能啟動(dòng)發(fā)酵，還保持著高產(chǎn)甘油和低產(chǎn)揮發(fā)酸的特性。

目前，關(guān)于優(yōu)良T. delbrueckii菌株的篩選及其對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響已成為國(guó)外研究者的熱點(diǎn)。Renault等[5]發(fā)現(xiàn)接種T. delbrueckii的混合發(fā)酵提高了紅葡萄酒的復(fù)雜性和果香風(fēng)味。Whitener等[8]指出某些特定的戴爾有孢圓菌株可生成高濃度的萜烯化合物，包括α-萜品醇、芳樟醇、香葉醇等，從而提高瓊瑤漿、雷司令等品種香氣。Ramírez等[9]篩選出具有嗜殺性的T. delbrueckii，并與S. cerevisiae混合發(fā)酵，結(jié)果顯示T. delbrueckii顯著提高了赤霞珠成品酒的口感以及香氣復(fù)雜度和濃郁度。

我國(guó)疆域遼闊，葡萄酒產(chǎn)區(qū)氣候變化多樣，優(yōu)越的自然條件孕育著豐富的酵母資源，來(lái)自不同地區(qū)的酵母對(duì)葡萄酒質(zhì)量的影響具有獨(dú)特的地理特征[10]，因此充分利用本土酵母資源，可以提高葡萄酒的“風(fēng)土”特征。然而，我國(guó)關(guān)于本土酵母對(duì)葡萄酒品質(zhì)影響的相關(guān)研究較少，具有葡萄酒釀造特色的本土酵母資源的分離、保藏和菌種庫(kù)的建立仍然十分欠缺，對(duì)本土非釀酒酵母的開(kāi)發(fā)利用更是寥寥無(wú)幾。T. delbrueckii作為優(yōu)良非釀酒酵母之一，具有多種應(yīng)用潛力。目前我國(guó)對(duì)T. delbrueckii的關(guān)注度不高，少有的關(guān)于T. delbrueckii的研究也是泛泛介紹了非釀酒酵母的發(fā)酵特性[7,11]，或是以商業(yè)T. delbrueckii為原材料[12]，僅針對(duì)其對(duì)香氣的影響[13]，至今鮮見(jiàn)關(guān)本土T. delbrueckii在葡萄酒中應(yīng)用的詳細(xì)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以從甘肅祁連酒廠冰酒釀造過(guò)程中分離得到的3 株T. delbrueckii為材料，對(duì)其耐受性和發(fā)酵性能進(jìn)行研究；按照小容器釀造工藝法，選取性能優(yōu)良的菌株T. delbrueckiiR12與S. cerevisiaeNX11424混合發(fā)酵釀造干紅葡萄酒，探究不同接種方式和接種比例對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，為T. delbrueckii在葡萄酒生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供參考，為優(yōu)質(zhì)葡萄酒的風(fēng)格塑造和本土葡萄酒的風(fēng)土多樣性表達(dá)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

T. delbrueckiiR12、R85、R150分離自甘肅祁連酒廠；S. cerevisiaeNX11424保藏于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院。

酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基（yeast extract protein dextrose，YEPD）、WLN（Wallerstein laboratory nutrient）培養(yǎng)基、YEPD-亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）培養(yǎng)基分別參照文獻(xiàn)[14-16]。Triple M模擬汁[17]：1.25% Tween80，3.75% 95%乙醇溶液，0.012 5%麥角固醇，10%葡萄糖，10%果糖，0.6%L-(+)-酒石酸，0.3%L-(-)-蘋果酸，0.05%檸檬酸，0.17% YNB，0.2%酸水解酪蛋白，0.000 6%肌醇，0.02%無(wú)水氯化鈣，0.08%L-精氨酸，0.1%L-脯氨酸，0.01%DL-色氨酸，0.1%磷酸銨，氫氧化鉀調(diào)pH 6.4。300 g/L和400 g/L高糖模擬汁參照Triple M模擬汁調(diào)整總糖質(zhì)量濃度，葡萄糖和果糖均按照1∶1添加，其余物質(zhì)質(zhì)量濃度不變。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；BK1301生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

將甘油管保藏菌劃線于YEPD固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2 d。在YEPD固體培養(yǎng)基上挑取菌落特征明顯的單菌落接種于YEPD液體培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h制成種子液。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將活化菌株按2%的接種量接種于40 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)，每株菌設(shè)3 組重復(fù)。每隔2 h取樣測(cè)定OD600nm，以未接種的YEPD培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.3.3 耐受性實(shí)驗(yàn)

在試管中添加不同耐受基質(zhì)（YEPD培養(yǎng)基）并加入杜氏管，按2%接種量接入活化菌株，28 ℃培養(yǎng)，設(shè)3 組重復(fù)，通過(guò)監(jiān)控產(chǎn)氣情況以確定接種菌株的生長(zhǎng)到達(dá)穩(wěn)定期后測(cè)定OD600nm。

1.3.3.1 乙醇耐受性

滅菌之后的YEPD培養(yǎng)基調(diào)整初始乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%、10%、12%、14%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 SO2耐受性

滅菌之后的YEPD培養(yǎng)基調(diào)整SO2質(zhì)量濃度為100、200、300、400、500、600 mg/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.3 高糖耐受性

調(diào)整YEPD培養(yǎng)基初始葡萄糖質(zhì)量濃度為200、300、400 g/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 酵母絮凝性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 酵母嗜殺性檢驗(yàn)[16]

將5 μL T. delbrueckii菌液點(diǎn)樣于均勻涂有S. cerevisiae NX11424的YEPD-MB培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)2～3 d。若待測(cè)菌為嗜殺菌，其周圍會(huì)形成藍(lán)色的死菌帶和透明抑菌圈。

1.3.6 模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

配制不同糖質(zhì)量濃度的模擬汁，先將酵母種子液以2%的接種量接種于50 mL模擬汁中，于25 ℃、90 r/min預(yù)培養(yǎng)24 h。隨后將預(yù)培養(yǎng)的酵母細(xì)胞，以5×105CFU/mL接種量接種于裝有300 mL模擬汁的發(fā)酵瓶中，20 ℃靜置發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中每24 h監(jiān)測(cè)CO2質(zhì)量損失，連續(xù)3 d CO2質(zhì)量損失不變示為發(fā)酵結(jié)束。每組重復(fù)3 次。發(fā)酵結(jié)束后，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]測(cè)定乙醇、殘?zhí)恰⒖偹岷蛽]發(fā)酸。

1.3.7 小容器發(fā)酵釀造干紅葡萄酒

赤霞珠葡萄于2016年采自陜西張?jiān)Ｈ鹉浅潜ぞ魄f，其總糖質(zhì)量濃度為270.1 g/L，可滴定酸質(zhì)量濃度為5.0 g/L（以酒石酸計(jì)），pH 3.14。

按干紅葡萄酒的小容器釀造法（2 L），葡萄破碎后添加60 mg/L SO2和600 mg/L二甲基二碳酸鹽殺菌處理，靜置24 h。將T. delbrueckii R12與S. cerevisiae NX11424按1∶1、10∶1和20∶1的比例同時(shí)接種或順序接種（間隔2 d接入S. cerevisiae）進(jìn)行混合發(fā)酵，其中R12接種量為1×106CFU/mL（血球板計(jì)數(shù)法），NX11424的接種量按比例計(jì)算；以R12和NX11424單獨(dú)發(fā)酵為對(duì)照，接種量均為1×106CFU/mL。發(fā)酵溫度25 ℃，每個(gè)處理3 組重復(fù)。采用WLN平板計(jì)數(shù)法[15,20]，依據(jù)酵母生長(zhǎng)狀況及發(fā)酵進(jìn)程對(duì)發(fā)酵過(guò)程中4 個(gè)階段（發(fā)酵啟動(dòng)時(shí)、糖消耗1/2時(shí)、糖消耗3/4時(shí)、發(fā)酵結(jié)束）的菌落數(shù)進(jìn)行監(jiān)控，其中S. cerevisiae NX11424菌落呈乳白色錐狀凸起，T. delbrueckii R12菌落呈奶油色球狀凸起，頂端呈綠色。通過(guò)測(cè)定還原糖監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程，發(fā)酵結(jié)束后參照GB/T 15038—2006測(cè)定葡萄酒基本理化指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用One-Way ANOVA法；Origin 8.5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 T. delbrueckii菌株的生長(zhǎng)曲線

圖1 T. delbrueckii菌株的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves of T. delbrueckii strains

如圖1所示，3 株T. delbrueckii在經(jīng)過(guò)約2 h的延滯期后，于接種后8 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，16 h后菌體數(shù)量基本保持穩(wěn)定。其中R150在YEPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力優(yōu)于其他兩株，生長(zhǎng)最快，穩(wěn)定期菌體數(shù)最大。

2.2 T. delbrueckii菌株的耐受性

在自然發(fā)酵的早期，非釀酒酵母是葡萄汁中的優(yōu)勢(shì)菌，然而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其優(yōu)勢(shì)地位逐漸被S. cerevisiae所取代，多數(shù)非釀酒酵母在乙醇發(fā)酵旺盛期時(shí)消失。非釀酒酵母的生長(zhǎng)主要受到發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、SO2添加量、低pH值、葡萄汁滲透壓及營(yíng)養(yǎng)等條件的影響[21]。因此，非釀酒酵母對(duì)糖、SO2、乙醇的耐受性將決定它們?cè)谄咸丫瓢l(fā)酵中所起的作用。

2.2.1 乙醇耐受性

在葡萄酒的生產(chǎn)過(guò)程中，酵母菌的主要作用是將糖代謝生成乙醇，但是當(dāng)培養(yǎng)基中的乙醇累積到一定體積分?jǐn)?shù)時(shí)，會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生有毒效應(yīng)。酵母的乙醇耐受性很大程度上影響了其在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的存活時(shí)間和發(fā)酵活性。本研究考察T. delbrueckii在8%～14%乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)的生長(zhǎng)狀況。如圖2所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，OD600nm持續(xù)下降，酵母生長(zhǎng)受到的影響越大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在10%以內(nèi)時(shí)，3 株菌均能保持一定的生長(zhǎng)量，其中R150的生長(zhǎng)量顯著高于另外兩株（P＜0.05）。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)升高到12%時(shí)，3 株T. delbrueckii的生長(zhǎng)才受到明顯抑制，說(shuō)明本土T. delbrueckii具有較強(qiáng)的乙醇耐受性。相關(guān)研究也表明，與葡萄汁有孢漢遜酵母、東方伊薩酵母等多數(shù)非釀酒酵母相比，T. delbrueckii具有更強(qiáng)的乙醇耐受力[22]，這也就確保了其在發(fā)酵過(guò)程中持續(xù)保持良好的發(fā)酵活性和正常的代謝活動(dòng)。

圖2 T. delbrueckii菌株的乙醇耐受性Fig. 2 Ethanol tolerance of T. delbrueckii strains

2.2.2 SO2耐受性

葡萄酒的釀造過(guò)程中，一般需要在葡萄汁中添加60 mg/L的SO2以達(dá)到抗氧化和殺菌的目的，足夠的SO2耐受力能確保酵母在發(fā)酵初期快速生長(zhǎng)繁殖。如圖3所示，3 株T. delbrueckii對(duì)SO2具有較強(qiáng)的耐受性。當(dāng)SO2質(zhì)量濃度小于200 mg/L時(shí)，3 株T. delbrueckii均能很好地生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀況受SO2含量影響不大。當(dāng)SO2質(zhì)量濃度在200～400 mg/L之間，3 株T. delbrueckii的生長(zhǎng)隨著SO2質(zhì)量濃度的增大而減弱，但仍能保持一定的生物量水平（OD600nm＞2.5），其中R150的生長(zhǎng)量高于其他兩株。當(dāng)SO2質(zhì)量濃度大于500 mg/L，三者的生長(zhǎng)均受到明顯抑制。

圖3 T. delbrueckii的SO2耐受性Fig. 3 SO2 tolerance of T. delbrueckii strains

2.2.3 高糖耐受性

葡萄汁高糖質(zhì)量濃度不僅抑制酵母生長(zhǎng)，同時(shí)影響細(xì)胞代謝[23]。如圖4所示，R150隨著糖質(zhì)量濃度的增加，OD600nm呈上升趨勢(shì)，400 g/L糖質(zhì)量濃度下依然保持著良好的生長(zhǎng)狀況。R12和R85對(duì)糖的耐受力無(wú)顯著差異，糖質(zhì)量濃度為400 g/L時(shí)R85具有更大的生長(zhǎng)量，而R12在300 g/L和400 g/L糖質(zhì)量濃度下均可保持良好的生長(zhǎng)（OD600nm＞2.5）。事實(shí)上，在高質(zhì)量濃度糖發(fā)酵的初期，細(xì)胞所受到的糖抑制作用大于乙醇的作用，當(dāng)糖度達(dá)到25°Brix時(shí)，乙醇發(fā)酵出現(xiàn)延滯；高于30°Brix時(shí)，單位糖的乙醇產(chǎn)率顯著降低[24]。此外，高質(zhì)量濃度糖造成的高滲透壓促使酵母菌產(chǎn)生更多的乙酸，使得冰酒、貴腐等甜型葡萄酒面臨揮發(fā)酸含量超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)[4,25]。從以上結(jié)果可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)從冰葡萄汁中篩選獲得的3 株T. delbrueckii對(duì)于高糖均具有很好的耐受性，這對(duì)于高糖葡萄汁發(fā)酵的順利進(jìn)行以及揮發(fā)酸含量的控制具有重要意義。

圖4 T. delbrueckii菌株的高糖耐受性Fig. 4 High sugar tolerance of T. delbrueckii strains

2.3 T. delbrueckii菌株的絮凝性

在葡萄酒的釀造過(guò)程中，酵母良好的絮凝性可使葡萄酒發(fā)酵液澄清速度加快，降低酵母分離的能量消耗，同時(shí)防止酵母細(xì)胞因長(zhǎng)時(shí)間懸浮在發(fā)酵液中導(dǎo)致細(xì)胞自溶而影響葡萄酒風(fēng)味[26]，也避免因絮凝性過(guò)強(qiáng)而造成發(fā)酵度低[27]。在酵母菌絮凝性評(píng)價(jià)中，絮凝值為70%～100%，屬于低絮凝性；絮凝值為30%～70%，屬于中絮凝性；絮凝值為0%～30%，屬于高絮凝性[18]。由圖5可知，3 株T. delbrueckii的絮凝值為48%～68%，均滿足葡萄酒釀造的需求。

圖5 T. delbrueckii菌株的絮凝性Fig. 5 Flocculation levels of T. delbrueckii strains

2.4 T. delbrueckii菌株的嗜殺性

嗜殺酵母在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中能夠分泌毒素，抑制或殺死敏感細(xì)胞[16]。由圖6可知，3 株T. delbrueckii周圍均無(wú)藍(lán)色死菌帯和透明圈，說(shuō)明3 株T. delbrueckii均對(duì)S. cerevisiaeNX11424無(wú)嗜殺作用。

圖6 T. delbrueckii菌株的嗜殺性Fig. 6 Killer activity of T. delbrueckii strains

2.5 不同糖質(zhì)量濃度下T. delbrueckii的發(fā)酵性能

2.5.1 發(fā)酵速率

圖7 不同糖質(zhì)量濃度下T. delbrueckii的發(fā)酵曲線Fig. 7 Fermentation curves of T. delbrueckii strains at different sugar concentrations

在葡萄酒釀造過(guò)程中，期望適宜的發(fā)酵速率，因?yàn)檫^(guò)快的發(fā)酵速度會(huì)導(dǎo)致溫度上升，生香過(guò)程縮短，葡萄酒品質(zhì)下降[28]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)CO2質(zhì)量損失監(jiān)控模擬汁的發(fā)酵進(jìn)程。由圖7可知，在3 種糖質(zhì)量濃度下，3 株T. delbruecki單獨(dú)接種發(fā)酵時(shí)間均較長(zhǎng)，發(fā)酵效率低，且隨著糖質(zhì)量濃度的升高，發(fā)酵力不斷降低。這符合一般非釀酒酵母相對(duì)低發(fā)酵力的特性。在糖質(zhì)量濃度為200 g/L的發(fā)酵液中，3 株菌株的發(fā)酵能力沒(méi)有顯著差異。在糖質(zhì)量濃度為300 g/L和400 g/L的發(fā)酵液中，3 株菌的發(fā)酵能力差異顯著，表現(xiàn)為R85＞R12＞R150。當(dāng)糖質(zhì)量濃度達(dá)到400 g/L時(shí)，3 株菌株的發(fā)酵均受到明顯抑制，總CO2質(zhì)量損失較另外2 個(gè)質(zhì)量濃度的處理降低將近一半。

2.5.2 理化指標(biāo)

表1 不同糖質(zhì)量濃度下T. delbrueckii菌株發(fā)酵酒樣的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical properties of wines fermented with three T. delbrueckii strains at different initial sugar concentrations

如表1所示，當(dāng)模擬汁糖質(zhì)量濃度為200 g/L時(shí)，三者均能完成發(fā)酵，殘?zhí)橇康陀? g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)在11%左右。相較于其他兩株菌，R12的揮發(fā)酸產(chǎn)量更低。當(dāng)糖質(zhì)量濃度為300 g/L時(shí)，3 株T. delbrueckii的發(fā)酵力受到不同程度的影響，殘?zhí)橇烤笥?0 g/L，其中R12和R85發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇糠謩e為46.10 g/L和36.60 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)均在15%左右，R150發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇縿t高達(dá)69.05 g/L。當(dāng)糖質(zhì)量濃度為400 g/L時(shí)，3 株T. delbrueckii的發(fā)酵能力急劇下降，即使是發(fā)酵能力最強(qiáng)的R85發(fā)酵液中殘?zhí)侨赃_(dá)264.99 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)6.75%，發(fā)酵能力較弱的R12和R150殘?zhí)橇糠謩e為295.11 g/L和315.65 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為5.80%和4.52%。總體來(lái)看，R85對(duì)糖的利用率更高，尤其是在高糖條件下。雖然T. delbrueckii在400 g/L YEPD高糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，但在同樣糖質(zhì)量濃度的葡萄模擬汁中并不能很好地完成發(fā)酵，這與菌株處于不同的生長(zhǎng)條件有關(guān)，在模擬汁的發(fā)酵過(guò)程中，酵母除受高糖滲透壓脅迫，還同時(shí)受到乙醇、低pH值等多因素的影響[23]。相關(guān)研究認(rèn)為T. delbrueckii作為非釀酒酵母中具有較強(qiáng)發(fā)酵力的菌株，能將大量的糖轉(zhuǎn)化為乙醇，可獨(dú)立完成乙醇度較低的某些特殊啤酒和起泡酒的釀造[29-30]，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)論一致。

2.6 T. delbrueckii和S. cerevisiae混合發(fā)酵

從上述研究結(jié)果可見(jiàn)，T. delbrueckii單獨(dú)接種進(jìn)行乙醇發(fā)酵往往耗時(shí)長(zhǎng)，且在含糖量較高的情況下難以完成發(fā)酵。因此采用混合發(fā)酵，對(duì)不同菌種“取長(zhǎng)補(bǔ)短”是當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)，也是提高葡萄酒品質(zhì)的有效方法之一。本研究綜合考慮耐受性、適宜的發(fā)酵力以及對(duì)模擬汁發(fā)酵后的感官香氣評(píng)價(jià)，選取香氣濃郁度更強(qiáng)的T. delbrueckiiR12與S. cerevisiaeNX11424進(jìn)行赤霞珠葡萄酒的混合發(fā)酵。發(fā)酵曲線如圖8所示，NX11424純種發(fā)酵的發(fā)酵速率最快，于第7天完成發(fā)酵。R12純種發(fā)酵耗時(shí)最長(zhǎng)，于第14天結(jié)束發(fā)酵。同時(shí)接種的3 組處理均于第9天左右完成發(fā)酵，其中處理T1發(fā)酵速率最快。順序接種的3 組處理的發(fā)酵曲線基本一致，共耗時(shí)11 d左右完成發(fā)酵。

圖8 不同接種方式和接種比例下的混合發(fā)酵曲線Fig. 8 Time-course curves of mixed-culture fermentation with different inoculums and inoculation methods

分別在發(fā)酵過(guò)程中的4 個(gè)時(shí)期取樣，采用WLN涂板計(jì)數(shù)的方法對(duì)菌株定植能力進(jìn)行考察，結(jié)果如圖9所示。不同處理下，T. delbrueckii和S. cerevisiae的數(shù)量在發(fā)酵過(guò)程中均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。相比于同時(shí)接種，順序接種處理中R12的最大增值量顯著提高（最大值S20約為4.0×107CFU/mL），且一直保持到發(fā)酵結(jié)束，而對(duì)應(yīng)的NX11424的最大增殖量則顯著降低，但發(fā)酵結(jié)束時(shí)不同處理的數(shù)量差別不大。在不同比例的處理中，NX11424接種量的增加均導(dǎo)致R12增殖數(shù)量的降低。在同時(shí)接種處理中，兩種酵母相互競(jìng)爭(zhēng)，生長(zhǎng)能力及耐受性更強(qiáng)的S. cerevisiae迅速占據(jù)主導(dǎo)地位，處于弱勢(shì)地位的T. delbrueckii種群數(shù)量下降較快。從圖9A、B可知，同時(shí)接種處理中，R12在st2時(shí)數(shù)量開(kāi)始下降，而順序接種處理的R12可增殖至st3。在順序接種處理中，由于T. delbrueckii的生長(zhǎng)空間更大，S. cerevisiae接入時(shí)T. delbrueckii數(shù)量已經(jīng)到達(dá)一定的水平，再加上此時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已被消耗，S. cerevisiae的增殖空間有限，較難成為優(yōu)勢(shì)菌群，在st3時(shí)，NX11424的數(shù)量低于R12。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本土T. delbrueckii在葡萄酒釀造過(guò)程中具有良好的定植能力，在發(fā)酵初期可快速增殖，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均能保持一定的生物量水平，可以影響葡萄酒的質(zhì)量風(fēng)格。相關(guān)研究也表明，T. delbrueckii在發(fā)酵過(guò)程中的強(qiáng)定植能力還能在一定程度上抑制其他有害微生物的生長(zhǎng)，有助于提升葡萄酒的質(zhì)量[31]。

圖9 不同接種處理發(fā)酵中T. delbrueckii與S. cerevisiae菌株在不同階段的數(shù)量變化Fig. 9 Populations of T. delbrueckii and S. cerevisiae at different stages of fermentation

表2 發(fā)酵結(jié)束后基本理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical properties of wines fermented with pure and mixed starter cultures

如表2所示，除R12單獨(dú)發(fā)酵，其余7 組處理發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇烤∮? g/L。8 組處理的乙醇體積分?jǐn)?shù)在12.0%～13.5%之間，其中NX11424單獨(dú)發(fā)酵和處理T1乙醇體積分?jǐn)?shù)最高，R12單獨(dú)發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)最低。8 組處理的揮發(fā)酸均小于0.6 g/L，其中T. delbrueckii純種發(fā)酵和混合發(fā)酵揮發(fā)酸產(chǎn)量均顯著低于S. cerevisiae純種發(fā)酵，且隨著T. delbrueckii所占比例的增加，揮發(fā)酸降低幅度增大。這也與Chen Kai等[32]報(bào)道的T. delbrueckii是低揮發(fā)酸生產(chǎn)者的研究一致。

3 結(jié) 論

目前大多數(shù)葡萄酒釀造多選用商業(yè)S. cerevisiae接種發(fā)酵，其優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵周期短、成品酒質(zhì)量穩(wěn)定。但這種同一化使酒體單一，缺乏個(gè)性。加強(qiáng)本土酵母資源和非釀酒酵母的開(kāi)發(fā)利用有助于釀造具有地方特色、風(fēng)格獨(dú)特的葡萄酒。本實(shí)驗(yàn)以甘肅祁連產(chǎn)區(qū)篩選出的3 株T. delbrueckii為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其生長(zhǎng)特性、絮凝性以及乙醇、SO2、高糖耐受性的分析發(fā)現(xiàn)，3 株T. delbrueckii均具有良好的生長(zhǎng)能力以及較好的高乙醇、高糖質(zhì)量濃度等逆境耐受性和中等絮凝性。為進(jìn)一步探究本土T. delbrueckii在實(shí)際葡萄酒釀造中的應(yīng)用潛能，本研究選擇T. delbrueckii R12與S. cerevisiae NX11424按照不同接種方式和接種比例混合發(fā)酵釀造赤霞珠干紅葡萄酒。混合發(fā)酵6 組處理均能完成乙醇發(fā)酵，且R12在發(fā)酵過(guò)程中，均保持了良好的定植能力，其中順序接種處理中R12的增殖量更大。另外，T. delbrueckii的接種比例對(duì)揮發(fā)酸含量有顯著影響，R12接種比例越大，發(fā)酵酒樣中揮發(fā)酸的含量則越低，這對(duì)甜型葡萄酒的釀造具有重要意義。

充分利用本土酵母資源，合理運(yùn)用混菌發(fā)酵策略，既降低了發(fā)酵過(guò)程中的不可預(yù)測(cè)性，又保留了非釀酒酵母的代謝足跡，是有效解決成品酒風(fēng)格單一的方法之一。本研究結(jié)果表明本土T. delbrueckii在葡萄酒的釀造中具有較大的應(yīng)用價(jià)值，在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步研究其與S. cerevisiae互作及對(duì)不同類型葡萄酒品質(zhì)指標(biāo)的全面影響，以期為我國(guó)優(yōu)良本土S. cerevisiae的選育工作及釀造風(fēng)格多樣化的葡萄酒提供指導(dǎo)。