重慶水豆豉自然發酵過程中色澤質構變化規律

梁葉星，張 玲,*，李 雪,*，張歡歡，熊家艷，張雪梅，高飛虎，楊世雄

（1.重慶市農業科學院農產品貯藏加工研究所，重慶 401329；2.重慶西南師范大學出版社有限公司，重慶 400716）

水豆豉是一種重慶及周邊地區傳統大豆發酵食品，同時也是本地的代表性調味品，是本地老百姓生活中必不可少的佐餐食品和調味料。同時由于其營養全面[1-2]，且具有抗腫瘤[3-4]、降血糖[5]、降血壓[6-8]、抗氧化[9-10]等多種生理功能，因此，重慶本地水豆豉的市場潛力巨大。

大豆發酵食品具有細膩的口感和誘人的色澤，因而深受廣大消費者的喜愛，消費需求量較大[5]。經過發酵，食品除風味外，其質地和色澤也隨之發生了顯著的變化，形成了大豆發酵食品獨特的品質特征。水豆豉是細菌型豆豉的代表產品，其參與制曲和發酵的主要微生物是枯草芽孢桿菌、乳酸菌等[11-12]。因其獨特的生產工藝，多樣性菌群結構和特殊的濕態發酵，使其成品具有與其他類型豆豉不同的口感和色澤，并具有特殊的風味。

目前對于我國傳統發酵豆制品品質發酵規律的研究較少，且研究主要集中在毛霉豆豉和曲霉豆豉，如索化夷[13]和Wang Lijun[14]等分別對毛霉豆豉和曲霉豆豉發酵過程中的品質變化進行了相關研究。雖然目前也有對水豆豉品質形成規律的相關報道，但沒有細菌型豆豉納豆研究深入，目前納豆已經實現了納豆菌純種發酵，并且對其生理功效[15-17]進行了深層次的研究，實現了商業化生產。水豆豉質構、色澤形成規律的相關研究還鮮見報道。由于重慶水豆豉通常是在自然條件下發酵而成，導致產品存在生產周期長、質量不穩定、生產受季節限制等問題，阻礙了其產品的推廣和發展。對自然接種重慶水豆豉發酵過程中質構色澤變化規律的研究，有利于評價其感官品質形成機制。

本研究動態對比分析了重慶本地大豆（重慶大豆）和東北大豆為原料生產的重慶水豆豉在自然發酵過程中各發酵時期色差、質地的變化，以期獲得兩種常用大豆資源作為水豆豉生產原料對其產品質構色澤品質形成影響的差異。通過相關性分析，發現并總結其變化規律，以期為構建重慶水豆豉感官品質特征參數、制定生產工藝品質標準提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料分別為重慶大豆和吉林東北大豆，經重慶地區傳統水豆豉生產工藝自然發酵，得到不同發酵階段的重慶傳統水豆豉。

3,5-二硝基水楊酸、羧甲基纖維素鈉、乙酸鈉、硫代硫酸鈉、冰乙酸、硼酸、鹽酸、硫酸鉀、甲醛 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

CT-3物性測定儀 美國Brookfield公司；CM-2300D色差儀 柯尼卡美能達（中國）投資有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；GL-12A高速冷凍離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；UV-6000PC紫外-可見光分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重慶傳統水豆豉生產工藝及樣品采集

重慶傳統水豆豉生產工藝：大豆篩選→浸泡→瀝干（煮豆水冷藏備用）→常壓蒸煮→冷卻→自然接種發酵→拌料（食鹽質量分數10%、姜粒、辣椒面、白酒）→入壇發酵后熟→成品。

樣品采集詳見表1，S1～S14分別代表不同發酵時期的重慶水豆豉樣品。檢測酶活力的樣品立即進行檢測，其余樣品經冷凍干燥后打粉過20 目篩，密封存放于-18 ℃冰箱中。

表1 實驗樣品的采集Table 1 Sampling scheme

1.3.2 水豆豉發酵過程中質構變化的測定[18]

取水豆豉發酵過程中不同時期完整樣品10 粒進行質構變化的測定，分別置于CT-3質構儀上進行檢測。選取的質構參數為硬度、彈性、內聚性及咀嚼性。

測定條件的設置如下：測定模式：TPA；目標類型：%形變；壓縮目標值：60%；觸發點負載：2 g；測試速率：1.00 mm/s；探頭類型：TA11/1000；夾具類型：TA-BT-KIT；探頭循環次數：2 次；可恢復時間：0 s。

1.3.3 水豆豉發酵過程中色差變化的測定[13]

將混勻的水豆豉粉末放入比色皿中按壓平整。對色差儀使用標準色板進行校正。將比色皿放置在色差儀檢測口下方，設置用反射模式進行測定。在儀器上讀出樣品的L值（黑白-亮度）、a值（紅色-綠色）、b值（黃色-藍色）。對每個樣品選取5 個不同位置點進行測定取平均值。

1.3.4 水豆豉發酵過程中纖維素酶活力的測定[13]

采用索化夷等[13]的方法略有改動，將水豆豉樣品采集后及時置于冰浴上研磨粉碎，混勻后稱取2.00 g樣品，轉入100 mL錐形瓶中并加入18 mL，0.1 mol/L pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，振蕩均勻，30 ℃、120 r/min搖床振蕩1 h。將溶液轉入50 mL離心管，室溫、4 000 r/min離心20 min。上清液用緩沖液定容至100 mL，備用。取樣品纖維素酶液1 mL于比色管中，50 ℃預熱。在樣品酶液和空白對照的比色管中加入50 ℃預熱的0.63 g/100 mL羧甲基纖維素鈉溶液4 mL，反應5 min后取出。在各比色管中加入1 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、2 mL 6.50 g/L 3,5-二硝基水楊酸溶液；同時在空白管中加入1 mL樣品酶液。置于沸水浴中加熱5 min進行反應顯色，顯色后冷卻至室溫。冷卻后的顯色液用蒸餾水定容至25 mL后，于540 nm波長處用分光光度計測定吸光度，根據下式計算纖維素酶活力：

式中：5為酶與底物作用時間，5 min；Ew為1 mL粗酶液的體積中所含樣品的質量/g。

1.4 數據分析

色差、硬度與氨基酸態氮回歸分析采用SPSS 19.0處理，回歸分析采用線性回歸，回歸系數置信區間選擇95%，雙變量相關采用Pearson線性相關，雙側檢驗，α=0.05為檢驗水準，P＜0.05，差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 水豆豉發酵過程中質構變化

圖1 水豆豉發酵過程中硬度的變化Fig. 1 Change in hardness during the fermentation process of Shuidouchi

從圖1、2可知，大豆原料硬度很大，測定值超過儀器負載，在浸泡后（S2）硬度下降到10 000 g左右，經過蒸煮（S3）過程后，硬度下降到2 000 g左右，說明浸泡和蒸煮過程是降低大豆硬度的主要因素。進入發酵階段，豆豉的硬度逐漸下降，一直到后發酵結束階段逐漸趨于平穩，豆豉硬度下降與其可溶性膳食纖維含量增大有關[19]。因為水豆豉后發酵過程一直保存在煮豆水中進行，所以其硬度和咀嚼性的變化趨勢與毛霉豆豉變化趨勢有一定差別[13]。水豆豉經過微生物和酶系作用，兩種水豆豉硬度由前發酵開始時（S4）的1 782 g和1 932 g分別下降到發酵成熟時（S14）的331 g和228 g。水豆豉咀嚼性變化趨勢與其硬度變化趨勢基本一致。這與索化夷等[13]研究的永川豆豉質構變化規律基本一致。重慶大豆發酵的水豆豉硬度和咀嚼性略高于東北大豆，重慶大豆發酵水豆豉硬度更接近于傳統商品水豆豉的硬度，說明用重慶大豆發酵水豆豉的口感更接近于傳統水豆豉。

圖2 水豆豉發酵過程中咀嚼性的變化Fig. 2 Change in chewiness during the fermentation process of Shuidouchi

圖3 水豆豉發酵過程中彈性的變化Fig. 3 Change in springiness during the fermentation process of Shuidouchi

圖4 水豆豉發酵過程中內聚性的變化Fig. 4 Change in cohesiveness during the fermentation process of Shuidouchi

由圖3、4可知，浸泡和蒸煮對彈性和內聚性無明顯改變，說明浸泡、蒸煮等物理因素對豆豉的彈性和內聚性影響較小，這與毛霉豆豉的彈性和內聚性變化規律基本一致。但彈性在后發酵階段的后期出現了下降的趨勢，這與蛋白酶、纖維素酶等酶系緩慢作用有關[20]。重慶大豆和東北大豆發酵水豆豉的內聚性變化趨勢差異不大，但是重慶大豆發酵水豆豉隨著發酵時間延長，其彈性下降趨勢比東北大豆趨勢更加明顯。

2.2 水豆豉發酵過程中的色差變化

圖5 水豆豉發酵過程中色差的變化Fig. 5 Changes in L, a, b values during the fermentation process of Shuidouchi

L值增大代表樣品顏色變白變亮，數值變小則是顏色變黑變暗。由圖5可知，水豆豉發酵過程中L值逐漸下降，L值在前發酵階段下降較快，在后發酵階段下降速度減緩，說明水豆豉在發酵過程中逐漸向黑色轉化，顏色逐漸變暗。b值增大表示顏色向黃色轉變，b值減小表示顏色向藍色轉變。在水豆豉發酵過程中b值逐漸增大，說明水豆豉的顏色逐漸變黃，形成水豆豉獨特的黃色或者黃褐色，這與配料中姜黃素被逐漸吸收到水豆豉當中有關。a值增高代表其顏色變紅，減小則表示顏色變綠，其值在前發酵階段（S3～S6）基本沒有變化，表明此時顏色變化不大，在發酵后期由于加入了辣椒粉，辣椒紅素在發酵過程中逐步被吸收到水豆豉當中，使得其a值逐漸變大，紅色逐漸加深，形成了水豆豉獨特的色澤，研究也發現a值增加與美拉德反應有很強的相關性，且鹽濃度越高對美拉德反應的影響作用越大[21-22]。

汪立君等[23]研究發現曲霉豆豉在加工過程中也隨著時間的推移顏色逐漸變暗，而用黑豆作為原料制作的納豆其色差L、a、b值卻是隨著發酵的進行逐漸上升，說明不同的發酵原料和發酵工藝對豆豉的色澤變化規律有不同的影響。

重慶大豆和東北大豆發酵的水豆豉色差L值和a值變化差異不顯著，但是重慶大豆發酵的水豆豉色差b值由原料的15.26上升到成熟時的29.02，上升了90.17%；而東北大豆發酵的水豆豉色差b值由原料的23.67上升到成熟時的27.20，僅上升了14.91%。b值變大說明了水豆豉向黃色轉變，水豆豉成熟時的顏色為黃色或黃褐色，說明重慶大豆發酵形成的水豆豉顏色更接近傳統水豆豉產品的顏色。

2.3 水豆豉發酵過程中纖維素酶活力變化

圖6 水豆豉發酵過程中纖維素酶活力的變化Fig. 6 Change in cellulose activity during the fermentation process of Shuidouchi

大豆約含有5%的纖維素是構成細胞壁的重要成分，纖維素包裹蛋白質、多糖等成分形成了穩定的網絡結構[24]。但其在纖維素酶作用下會發生降解，導致大豆的硬度、咀嚼性和彈性下降，進而對大豆質構產生影響。如圖6所示，在前發酵階段（S3～S6），水豆豉中纖維素酶活力隨發酵的進行逐漸升高。重慶大豆和東北大豆發酵的水豆豉纖維素酶活力分別由前發酵初期（S4）的0.37 U/g和0.40 U/g上升到前發酵末期（S6）的0.64 U/g和0.67 U/g，總體上與錢家亮[24]報道的細菌豆豉纖維素酶活力含量較低的結論一致。進入后發酵階段（S7以后），由于食鹽、白酒等高滲透作用抑制了酶的活力，導致酶活力大幅度下降，到豆豉成熟時僅分別維持在0.02 U/g和0.04 U/g。發酵過程中東北大豆發酵水豆豉的纖維酶含量略高于重慶大豆，這也是導致東北大豆發酵的水豆豉硬度較低的原因之一。

2.4 水豆豉發酵過程中蛋白酶活力的變化

由圖7可知，在水豆豉前發酵階段（S3～S6）中，酸性蛋白酶活力最初上升較快，而后由于總酸的下降而降低，之后逐漸趨于平穩；而水豆豉發酵的主要蛋白酶為中性蛋白酶和堿性蛋白酶，在前發酵階段（S4～S6），其活力增加較快，在前發酵的最后1 d達到峰值，進入到后發酵階段（S7以后），由于經過拌料加入了食鹽、白酒、辣椒面，在這種高滲透壓的環境下，大量的微生物死亡，蛋白酶的活力快速降低，在發酵的末期始終呈下降的趨勢。在毛霉型和曲霉型豆豉研究中也發現，降低產品的鹽含量，可以提高其蛋白酶活力。從圖7可知，重慶大豆發酵的水豆豉其酶活力高于東北大豆發酵的水豆豉，主要是由于重慶大豆蛋白質、還原糖等含量更高，更利于微生物的發酵作用。

圖7 水豆豉發酵過程中蛋白酶活力的變化Fig. 7 Changes in protease activities during the fermentation process of Shuidouchi

2.5 氨基酸態氮含量與色差、質構變化相關性分析

水豆豉發酵過程中顏色逐漸變暗是其成熟的標志之一，與美拉德反應的發生有關。而其口感的變化與其硬度的逐漸減小也有關系。氨基酸態氮作為豆豉發酵過程中一項重要的指標，其含量水平與發酵過程中蛋白質的降解過程息息相關[25]，直接對水豆豉的色差和質構變化產生影響，所以水豆豉色差和質構的變化與氨基酸態氮含量之間應該有一定的相關性。

圖8 水豆豉加工過程中氨基酸態氮含量的變化Fig. 8 Change in amino acid nitrogen content at different fermentation stages of Shuidouchi

由圖8可知，在發酵開始前（S1、S2），氨基酸態氮含量極低且變化不大。在前發酵階段（S4～S6）氨基酸態氮含量緩慢上升，到后發酵階段（S7）開始，氨基酸態氮含量快速上升，在后發酵第3天左右（S8）達到峰值，此時累積的氨基酸態氮含量最高，之后其含量增加緩慢后逐漸趨于平緩，這主要是由于在發酵的前期各種酶活力都較高，代謝產生的有機酸對酶活力影響較小，到后發酵階段，由于有機酸含量不斷累積，pH值下降，最終導致蛋白酶的活力逐漸降低。重慶大豆發酵水豆豉的氨基酸態氮質量分數最終上升為1.46%，東北大豆發酵的水豆豉的氨基酸態氮質量分數最終上升為1.36%，總體上重慶大豆發酵產生的氨基酸態氮含量高于東北大豆發酵產生的氨基酸態氮含量。氨基酸態氮含量在前發酵階段變化不大，主要在后發酵過程中增長較快。

通過對水豆豉L、a、b值及硬度與氨基酸態氮含量進行Pearson相關性分析。由表2可知，兩種大豆發酵的水豆豉氨基酸態氮與其L值、硬度呈負相關（P＜0.05），這與毛霉豆豉發酵過程中L值的結論相一致[13]，說明豆豉在發酵過程中顏色都是在逐漸變暗，主要是由美拉德反應所致。氨基酸態氮變化值與a、b值呈正相關，a、b值的結論與毛霉豆豉結論相反，這說明水豆豉與毛霉豆豉不同，其紅綠值和黃藍值的轉化方向相反，這也是水豆豉最后形成了與其他品類豆豉顏色不同的原因之一。

表3 氨基酸態氮與色差、硬度回歸方程檢驗Table 3 Test of regression equations between amino acid nitrogen content and color and hardness

如表3所示，以氨基酸態氮含量為因變量，L、a、b值及硬度為自變量分別進行線性回歸分析，回歸方程L、a、b值及硬度有統計學意義，且色差L值能分別解釋氨基酸態氮變量的74.5%和86.3%，色差a值能分別解釋氨基酸態氮變量的72.9%和75.2%，色差b值能分別解釋氨基酸態氮變量的71.1%和56.6%，硬度僅能分別解釋氨基酸態氮變量的35.0%和37.8%。由相關性分析可知兩種大豆發酵生產的水豆豉，其a值和硬度值解釋氨基酸態氮變量的值差異不大，但是L值和b值解釋氨基酸態氮變量的值有一定差異。

3 討論與結論

水豆豉的品質特征主要由其色澤、口感、風味等構成，其中色澤和口感是水豆豉產品品質優劣很重要的兩方面內容。通過對其發酵過程中質構和色差的分析發現，水豆豉軟滑口感主要取決于浸泡、蒸煮作用和后發酵各種酶系作用兩方面。浸泡和蒸煮過程使得水豆豉原料的硬度大幅度下降，原本干硬的大豆迅速吸水彭潤，松散了組織結構，硬度快速下降，Luo Yangchao等[26]研究表明，延長蒸煮時間相對于延長浸泡時間更能顯著降低豆豉的硬度，說明浸泡和蒸煮過程在改善豆豉原料硬度方面蒸煮作用影響更大。Cober[27]、Maestri[28]等在對納豆的研究中發現，大豆的浸泡吸水率、蒸煮損失等物理特性與納豆的成分含量之間存在明顯的相關性，且對納豆產品的理化特征和感官品質有影響作用。在后發酵階段，兩種大豆發酵的水豆豉硬度分別從1 273.67 g和1 223.67 g下降到水豆豉成熟時的331.67 g和288.33 g。這一階段主要是由于前發酵階段微生物作用產生的酶系在后發酵過程中仍然保持了一定的活力，以及后發酵過程鹽水的水分滲透的共同作用，導致大豆的組織結構遭到破壞，硬度下降。后發酵過程中導致硬度下降的主要因素是蛋白酶和纖維素酶等酶系作用，研究發現后發酵的鹽濃度和時間對水豆豉硬度的影響顯著[29]。水豆豉特征色澤形成主要是由兩方面因素影響，一方面大豆發酵過程中逐漸變暗是由于美拉德反應，Zhang Yuhao等[30]研究發現蛋白質水解物中多肽和游離氨基酸與毛霉豆豉的顏色變化具有高度的相關性，水解物中親水性成分的丟失與其參與美拉德反應有關。在前發酵階段，酶活力較高，生成氨基酸和還原糖的速度快[31]，美拉德反應在此階段反應速度較快，故水豆豉的L值主要在該階段大幅度下降，水豆豉顏色明顯變暗。另一方面，在后發酵階段，由于加入鹽、白酒等形成高滲透壓環境，酶活力降低，氨基酸和還原糖生成量降低，美拉德反應速度減緩，所以水豆豉變暗的速度減緩，此階段a值和b值上升較快，主要是辣椒和姜粒的加入，辣椒紅素和姜黃素逐漸滲透到水豆豉當中所致，形成了水豆豉獨特的黃色或者黃褐色。

水豆豉發酵過程中咀嚼性的變化趨勢與其硬度變化趨勢基本一致。水豆豉的內聚性和彈性在發酵過程中變化不大，在后發酵階段彈性出現小幅下降的趨勢。在后發酵階段，纖維素酶的活力較低，但纖維素酶在與蛋白酶等其他酶的共同作用下，破壞了水豆豉的纖維素、蛋白質、多糖等成分共同構成的網絡組織結構，使水豆豉硬度進一步下降。通過回歸分析發現水豆豉的硬度變化與其氨基酸態氮含量呈負相關，但相關性較低。

豆豉發酵過程中色差值變化明顯，L值在前發酵階段下降較快，后發酵階段下降速度減緩，說明豆豉在發酵過程中一直在變暗。a值和b值顯著增大，說明水豆豉顏色在向黃色和紅色轉變，形成了水豆豉獨特的黃色或黃褐色。通過回歸分析發現豆豉色差值變化與其氨基酸態氮含量有相關性，L值呈負相關，a值和b值呈正相關，其中L值與氨基酸態的相關性最高，色差L值能解釋氨基酸態氮變量的74.5%和86.3%，結果表明可以用色差L值和a值預測豆豉氨基酸態氮含量，進而評價水豆豉是否發酵成熟。

重慶大豆和東北大豆發酵的水豆豉產品在自然發酵過程中氨基酸態氮含量、質構、色差的變化趨勢基本一致，但重慶大豆作為水豆豉生產原料，其發酵的水豆豉產品的氨基酸態氮含量更高，其質構和色差參數更接近于傳統商品水豆豉。因此，重慶大豆更適合于作為重慶水豆豉產品生產原料。