東方伊薩酵母和釀酒酵母混合發酵楊梅酒的發酵效率及風味特征分析

張文文，翁佩芳*，吳祖芳

（寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315800）

楊梅（Myrica rubraSieb. et Zucc.）是我國傳統特產水果，楊梅顏色鮮艷，酸甜適口，具有較高的營養價值和重要的藥用價值[1]。但是由于楊梅沒有果皮保護，又成熟于高溫多雨的5—7月，使得楊梅易腐爛而難保藏，在4 ℃條件下只能存放9～12 d[2]，往往不能及時銷售和加工而造成大量浪費。隨著果酒成為國家重點發展的酒類及人們對健康生活方式的追求，以水果為原料釀造具有一定保健功效的各類果酒需求量逐年增加[3]。利用楊梅原料釀造的楊梅酒，香醇爽口，具有高營養、低乙醇體積分數的特點，不僅提高楊梅附加值，而且滿足各類消費群體對高質量生活的追求[4]。

酵母菌是果酒生產的一個關鍵要素，直接影響到楊梅酒的風味質量[5]。目前，國內楊梅果酒釀造所用酵母菌幾乎都是商業化酵母，應用于楊梅酒發酵會造成酒體風味不足，不能滿足消費者的需求[6]。非釀酒酵母從變質的酒體中分離出來，曾一度被認為是果酒發酵過程中的腐敗酵母菌，但隨著果酒釀造研究的深入，非釀酒酵母對果酒品質的作用得到了肯定[7-8]。它們可以合成多種酶，將原料中的前體物質轉化為酯、酸、高級醇等風味物質，并對果酒的色澤產生重要影響，但也存在一些缺陷，比如耐乙醇能力弱（尤其在SO2存在條件下）、發酵力低以及乙酸產量高等。因此，采用釀酒酵母與非釀酒酵母進行混合發酵是當前的研究熱點之一。鐘瑞敏等[9]發現葡萄酒釀酒活性干酵母作為主發酵菌種，成品酒酒色偏淡，且酒香單薄，但若配合0.1%生香酵母或釀酒高活性酵母可在一定程度上改善楊梅酒酒質。賈言言等[10]研究發現，梅奇酵母（Metschnikowia agaves）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）順序接種發酵時，能更好地保留原果香，并增加香氣成分的種類及乙酸酯類含量。類星形假絲酵母菌（Candida stella）和畢赤發酵酵母（Pichia fermentans）與Sc混合發酵可以增加巴貝拉紅葡萄酒中酯類、脂肪酸和降異戊二烯化合物濃度[11]。耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans）可以提高發酵液總酸度并增加苯乙醇、甘油的含量；梅奇酵母（M.agaves）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis，Io）和有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）能積累更多的高級醇[12]。粟酒裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces pombe）則可降解蘋果酸并產生較多的甘油、酯類和乙酸[13]。釀酒酵母與非釀酒酵母共發酵是調節果酒揮發性成分、提高果酒香氣復雜性的重要途徑。

關于混菌發酵楊梅酒，國內研究集中在工藝優化方面，對其內在機理的探究鮮見報道，由于楊梅酒的地域特色，國外學者對楊梅酒也少有研究。鑒于商業化釀酒酵母能夠耐受較高濃度乙醇，具有較強的有限營養物質競爭能力，保障果酒風味[14]，又由于楊梅中尖酸味的蘋果酸含量多[15]，以楊梅為原料釀制而成的楊梅酒含酸量也較高，而Io能夠降低果酒中的蘋果酸[16-17]。本研究將目前使用的商業化Sc（安琪葡萄酒活性干酵母）和實驗室自主分離篩選獲得的產風味較好的非釀酒酵母（Io166）混合發酵，分析對發酵周期的影響，并探討相關代謝物對楊梅酒感官特性（風味）的影響，以期為高品質楊梅酒的質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅：荸薺種楊梅，采于浙江省寧波市余姚，采摘后1 h內運到實驗室，采用榨汁機獲得楊梅汁，并經4 層無菌紗布過濾，使用前-80 ℃冷凍保存。使用時在常溫下自然解凍。

菌種：Io166為寧波大學食品生物技術實驗室保存；安琪葡萄酒活性干酵母（菌種鑒定為酵母屬Sc菌株），購自安琪酵母股份有限公司。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、碳酸鈉、殼聚糖（均為分析純） 國藥集團化學試劑上海有限公司；酒石酸鉀、碳酸鉀（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蔗糖（食品級） 市購；偏重亞硫酸鉀（食品級） 煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B-7000C氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀 美國Agilent公司；DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm） 美國Supelco公司；SpectraMax 190酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅酒釀造工藝流程

楊梅原汁制備→過濾→成分調整（碳酸鈉調pH 3.5，蔗糖調糖度22°Brix）→巴氏滅菌（75 ℃，15 min）→添加SO2（100 mg/L偏重亞硫酸鉀）→加酵母控溫發酵（27 ℃）→虹吸分離→后發酵1 個月（18 ℃）→澄清（80 mg/L的殼聚糖）→降酸（2 g/L酒石酸鉀+1 g/L碳酸鉀）→冷凍1 周（4 ℃）→過濾（0.22 μm濾膜）→灌裝→楊梅酒

楊梅酒的混菌發酵是將Io與Sc分別以6×106、6×105CFU/mL同時接入處理過的楊梅汁中，進行混合發酵，以Io和Sc單菌發酵楊梅汁作為對照，Io和Sc純種發酵液中的初始接種濃度分別為6×106CFU/mL和6×105CFU/mL。

1.3.2 酵母生長、總糖、還原糖和乙醇體積分數的測定

酵母生長測定：采用YPD平板計數法，其中混合發酵中，依據兩種酵母菌在YPD固體培養基上菌落形態不同計數。總糖及還原糖含量測定：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[18]；乙醇體積分數：采用愛爾蘭Megazyme公司乙醇測定試劑盒測定。發酵效率以總糖降至5 g/L時所需發酵時間作為考察指標。

1.3.3 GC-MS分析

1.3.3.1 揮發性風味物質頂空固相微萃取（head space solid phase microextraction，HS-SPME）

吸取5 mL楊梅酒于頂空瓶中，再加入1.4 g氯化鈉，和無水乙醇稀釋過的10 mg/L仲辛醇20 μL作為內標，于60 ℃平衡15 min。將老化后的固相微萃取頭插入平衡后的樣品頂空恒溫振蕩萃取30 min，振蕩速率為250 r/min。取出插入氣相色譜柱的進樣口解吸附7 min，解吸溫度為210 ℃。

1.3.3.2 GC-MS條件

色譜條件：毛細管柱為Vocal（60 m×0.32 mm，1.8 μm）。載氣為高純氦氣，恒定流速3 mL/min，進樣口溫度210 ℃，不分流進樣模式。柱溫箱采用程序升溫，起始溫度35 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升到40 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升到200 ℃，保持20 min。

質譜條件：采用全掃描模式采集信號，電離方式為電子電離，電子轟擊能量為70 eV；接口溫度220 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質量范圍m/z 40～600，掃描頻率3.6 scans/s。

1.3.3.3 定性定量分析

化合物經計算機檢索與NIST 14 Library相匹配。選擇較高匹配度的檢索結果，并結合文獻報道的已知化合物確認檢測物成分，各化合物含量根據內標2-辛醇進行定量。

1.3.4 感官分析

采用定量描述分析方法，由6 位經驗豐富的感官品評員（3 名女性和3 名男性）對楊梅酒進行評價，獲得評價選用的主要感官描述詞。品評員被要求在每一個描述詞上對楊梅酒樣本按照5 點標度法進行打分。0～5 分別表示沒感覺、弱、稍弱、平均、稍強和強。

1.4 數據處理

采用軟件Origin 9.1（Northampton，MA，USA）作圖，SPSS 24.0統計分析軟件進行數據處理，應用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan法差異分析，P＜0.05，差異顯著；對3 種楊梅發酵酒香氣成分的含量進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同發酵體系中酵母菌的生長變化情況

在釀酒過程中，非釀酒酵母種類廣泛且具多樣性，其濃度在101～106CFU/mL之間[19]，結合前期對Io和Sc生長曲線測定結果，及避免Sc旺盛繁殖對Io的抑制作用，從而影響楊梅酒成品的香氣成分，故混菌發酵液中Io和Sc初始濃度分別選擇了6×106CFU/mL和6×105CFU/mL。

圖1 不同菌種發酵體系中酵母菌生長動態變化Fig. 1 Dynamic changes in yeast growth in different fermentation systems

從圖1可以看出，在純種發酵中，Sc的生長速率較Io快，雖然Sc的起始接菌量不高，但在24 h細胞濃度有近108CFU/mL。同樣，Io純種發酵中，Io在前24 h快速增殖，之后Io生長勢頭減弱，穩定增長至發酵第9天達到峰值，之后開始衰亡，此時發酵液的乙醇體積分數為5.48%。而Sc純種發酵至第6天后開始衰亡，此時發酵液的乙醇體積分數為9.95%。說明Io和Sc分別在乙醇體積分數為5%和10%時生長受到抑制。

在混菌發酵體系中，Io和Sc表現出相似的生長規律，都在發酵第2天細胞濃度達到最大值，此時發酵液的乙醇體積分數為4.54%，此后Io迅速衰亡，至發酵第9天幾乎不能檢測到，這與Io純種發酵結果具有一致性，說明Io對乙醇較為敏感，易受到乙醇的脅迫作用。Miao Yingjie等[20]的研究顯示，乙醇脅迫會導致分子伴侶HSP 90和HSP 70以及泛素-蛋白酶體途徑相關的基因上調，致使蛋白錯誤折疊并形成聚集體毒害細胞。混菌體系中，Sc與Io呈現相似的生長規律，即發酵2 d后細胞開始衰亡，由此推測，兩者細胞濃度的下降可能與混合發酵體系中營養物質的競爭和細胞的群體感應等因素有關。研究表明，Io在乙醇脅迫下許多參與養分吸收的基因上調[20]。劉茜等[21]發現Io代謝精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸的速率較Sc快。Renault等[22]研究了混合發酵體系中戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）和Sc的生長變化，發現酵母細胞間的接觸抑制造成了T. delbrueckii的早期死亡。

2.2 不同發酵體系中pH值、總糖和還原糖的變化分析

圖2 不同菌種發酵體系中pH值（A）、總糖質量分數（B）和還原糖質量分數（C）的變化Fig. 2 Changes in pH (A), total sugar content (B) and reducing sugar content (C) in different fermentation systems

從圖2A可以看出，不同菌種及其混合發酵方式下發酵液的pH值呈現相同的變化趨勢，當pH值下降到一定程度后又會緩慢上升，發酵前期，酵母菌利用發酵液中糖類進行生長繁殖，產生一些酸類物質，故使發酵液中的pH值降低。這個結果與發酵第1天Sc在純種發酵體系和混菌發酵體系中迅速增殖的現象相吻合。發酵后期，酵母菌處于旺盛的乙醇發酵階段，部分酸類物質與發酵過程中產生的醇類物質發生酯化反應，故pH值升高[23]。而混菌發酵和Sc發酵pH值變化基本同步，在主發酵第2天pH值達到最低，分別為3.29和3.26，這與混菌發酵液中Sc大量增殖，發酵階段競爭能力較強有關。

糖是乙醇發酵的基質，酵母菌將可發酵性糖轉變成乙醇、CO2和其他一些副產物。從圖2B可以看出，Io發酵液總糖含量下降緩慢，說明Io作為非釀酒酵母，對糖的利用效率顯著低于Sc。前期實驗中，分別對Io和Sc進行不同碳源（蔗糖、葡萄糖和果糖）的純培養生長測定，發現Io在以葡萄糖和果糖為碳源時具有較好的生長量，而蔗糖利用性相對較差，可能由于葡萄糖和果糖作為可發酵性糖，可以直接進入糖酵解途徑被菌體利用，因而菌體生長較快；蔗糖被菌體利用時，首先需要在二糖水解酶的作用下水解形成單糖，因而菌體生長較慢。而Sc對這3 種碳源利用能力基本相同。從圖2C也可以看出，Io優先利用還原糖進行楊梅酒發酵，而Sc將蔗糖水解成果糖和葡萄糖的同時，也能實現對糖的快速利用。故混菌發酵液中殘余總糖含量能被快速消耗，且第11天發酵液殘糖量就小于5 g/L，比Sc發酵酒提早結束主發酵。

2.3 不同發酵體系中揮發性風味物質比較

香氣是衡量果酒品質的重要指標之一，香氣的形成過程復雜，按照來源可以概括為品種香、發酵香和陳釀香，其中果酒中主要的香氣物質是通過酵母菌的乙醇發酵作用下轉化而來，故酵母對果酒香氣的形成起著至關重要的作用[24]。采用HS-SPME-GC-MS對混菌發酵楊梅酒和純種發酵楊梅酒進行揮發性風味物質測定，結果如表1所示。

表1 混菌發酵和純種發酵楊梅酒中揮發性風味物質含量Table 1 Comparisons of volatile flavor compounds of Chinese bayberry wines from pure and mixed-culture fermentations

續表1

由表1可以看出，酵母菌純種發酵及混合發酵的楊梅酒中共鑒定出59 種揮發性風味成分，包括酯類30 種、醇類7 種、酸類6 種、烯萜類3 種、醛類2 種、酮類2 種、烴類及其他類9 種；其中含量較高的是辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇、反式石竹烯和2,3-環氧-4,4-二甲基戊烷。以下從酯類、醇醛酮類及酸類揮發性風味物質解析不同發酵體系對楊梅酒香氣形成的影響。

2.3.1 酯類物質

酒風味在很大程度上與酯類的組成及含量有關，酵母菌在乙醇發酵過程中通過酯酶或醇酰基轉移酶的作用下可形成多種酯類[25]，含量最豐富的為乙酸酯（乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯和2-乙酸苯乙酯），其次為飽和脂肪酸乙酯（丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯）[19]。從實驗結果得到，酒的風味在很大程度上與酯類的組成及含量有關，Io發酵產生10.634 mg/L的總酯，而Sc發酵產生酯類總質量濃度達19.832 mg/L，主要歸因于癸酸乙酯的高產，而癸酸乙酯會賦予酒體果香和酒香及白蘭地似的香韻。釀酒酵母細胞內的EHT1和EEB1基因編碼醇酰基轉移酶，是酵母中鏈脂肪酸乙酯合成的關鍵基因，Sc純種發酵中辛酸乙酯、癸酸乙酯等酯類含量較高可能與EHT1基因的過量表達有關[26-27]。除癸酸乙酯和辛酸乙酯外，月桂酸乙酯也是Sc產生的特征風味物質，質量濃度達到2.291 mg/L。相比Io發酵，混菌發酵使得癸酸乙酯、辛酸乙酯和月桂酸乙酯等含量顯著提高，還產生了癸酸異戊酯，增加了酒體香氣的復雜性。

30 種酯類物質中，乙酸芳樟酯、醋酸-2-乙基己酯、反式-2-辛烯酸乙酯為Io發酵產生的特有風味成分；而乙酸乙酯是Io的特征風味物質，其質量濃度高達3.421 mg/L，約為Sc發酵含量的10 倍。文獻表明，乙酸乙酯的形成以乙醇為底物，而乙醇脫氫酶基因ADH1在乙醇發酵過程中將乙醛還原成乙醇，因此，Io對乙酸乙酯的合成能力與醇脫氫酶基因ADH1表達情況有關[26]。乙酸乙酯質量濃度在100 mg/L以下時會賦予酒體令人愉快的芳香氣味，但如果質量濃度過大，會使酒出現指甲油的氣味[28]。相比Sc純種發酵，混菌發酵使得乙酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯和辛酸異戊酸等呈味物質含量有較大提高，使酒體口感豐滿。釀酒酵母中編碼醇酰基轉移酶的ATF1、ATF2表達量控制著乙酸酯類化合物在體內合成，其中ATF1基因作用優于ATF2基因[26]。Barbosa等[27]發現混菌發酵過程中，乙酸乙酯、乙酸異戊酯等乙酸酯類含量的增加與發酵過程中釀酒酵母ATF1的高表達有關。

2.3.2 醇、醛、酮類物質

高級醇是酵母菌乙醇發酵的副產物，高級醇合成主要是通過艾利希途徑將氨基酸作為底物轉氨脫羧再由醇脫氫酶還原而成如2-甲基-1-丁醇可由異亮氨酸轉化而來的，此外，酵母也能從糖代謝的碳片段形成高級醇[29]。實驗表明，純種發酵和混菌發酵共檢測出7 種高級醇，其中苯乙醇具有特殊的玫瑰香氣和先苦后甜的桃味，相比純種發酵，混菌發酵苯乙醇含量大量增加，達到11.737 mg/L，可能與ARO1、ARO7和ARO8等芳香族氨基酸合成相關基因的高表達有關[27]。此外，Sc合成高級醇的能力強于Io，可能是Sc具有較高的醇脫氫酶活力[30]。相比Io純種發酵，混合發酵高級醇含量提高了162%，2-甲基-1-丁醇、正丁醇和2-乙基己醇等含量有所增加。可能原因是Io在發酵后期的自溶為Sc提供營養物質，或者Io具有某些酶活性，能夠為Sc提供營養來源[31]如果膠酶、淀粉酶和木聚糖酶[32]。混合發酵得到的高級醇質量濃度在300 mg/L以下，能夠賦予酒體芳香味[33]。

另外，Io的存在使得發酵液中4-萜烯醇和苯乙酮含量增加，但值得注意的是在混菌發酵條件下，未檢測到壬醛（具有強烈的脂肪氣味）成分。

2.3.3 酸類及烯萜類物質

乙酸含量是影響發酵酒質量的一個重要因素，超過0.7 g/L會產生刺鼻氣味和不良口感[19]。3 種發酵液中，乙酸為Io發酵液所特有，質量濃度較高，達到0.472 mg/L，也是以上結果分析中乙酸酯類含量較高的原因。乙酸的產生與維持細胞內氧化還原平衡密切相關[34]，由此可解釋高糖等高滲透脅迫發酵條件下乙酸產生的原因。而Sc純種發酵液未能檢測到乙酸，與Io純種發酵相比，混菌發酵也降低了發酵過程中乙酸質量濃度。

己酸、辛酸、癸酸等中鏈脂肪酸（C6～C12）是酵母發酵過程中合成細胞膜所需長鏈脂肪酸的剩余片段，其積累對酵母的生長有毒性作用[19]。且己酸、辛酸和癸酸這3 種化合物會使酒體帶有不愉快氣味。其中，正癸酸是Sc發酵所特有的，正癸酸使得酒體有輕微腐臭味。混菌發酵后，正癸酸的含量降低至檢出限以下，同樣，混菌發酵使得己酸和辛酸含量也有所下降。

萜類化合物是自然界廣泛存在的一大類異戊二烯衍生物，對人體具有較強的生理活性[35]。3 種發酵方式的楊梅酒中共檢出3 種烯萜類化合物。Io純種發酵產生的烯萜類物質質量濃度最高，達到2.706 mg/L；相比純種發酵，混菌發酵后，除γ-芹子烯的含量稍有增加外，烯萜類物質總體含量減少。

2.4 楊梅酒揮發性風味成分主成分分析

表2 主成分特征值及其貢獻率Table 2 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

由表2可知，第1主成分貢獻率為70.090%，第2主成分貢獻率為14.049%，2 個成分的累計貢獻率達到80%，所以2 個主成分能夠有效解釋變量信息。

由圖3a可知，第1主成分與乙酸乙酯等重要酯類、乙酸及反式石竹烯呈顯著正相關，與辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇、苯甲醛等呈顯著負相關；第2主成分與反式-4-癸烯酸乙酯、正癸酸、壬醛呈正相關，與γ-芹子烯呈負相關。

由圖3b可知，3 種發酵楊梅酒分別位于不同象限可以反映出三者的整體風味有較大差異。Io發酵酒在第1主成分上的得分較高，說明Io發酵酒乙酸乙酯、乙酸及反式石竹烯含量較高；Sc發酵酒在第2主成分上的得分較高，說明反式-4-癸烯酸乙酯、正癸酸、壬醛含量相對較高。而Sc發酵酒和混菌發酵酒在第1主成分上的得分接近可知兩者在風味成分上相似度高，可能由于Io在發酵早期因為乙醇毒性等原因而消亡，而后起主導作用的Sc有效地影響混合發酵生產的楊梅酒香氣特征。

圖3 混菌發酵和純種發酵楊梅酒中揮發性風味物質的主成分分析圖Fig. 3 Principal component analysis score and loading plots of the volatile aroma compounds produced from pure and mixed-culture fermentations

2.5 整體感官評價分析

通過對不同發酵方式下楊梅酒風味的感官評定，得出楊梅酒的主要香型為果香、甜香、酸味、乙醇味、澀味和酵母味，如圖4所示。除乙醇味以外，果香和酸味是Io發酵酒最主要的風味，而酯類和酸類分別是貢獻果香和酸味的主要物質。不同的酯類物質在香氣感知時相互之間具有累加效應，楊梅酒的果香來自于混合酯類的作用，但是果香感知的強度并不與總酯類含量呈正比，而與其間特殊的比例相關[36]，這也就解釋了雖然Sc產酯量最高，但是發酵液中果香味較弱的原因。不同的乙醇發酵過程中產生的一些雜醇類和直鏈脂肪酸如2-甲基丁醇、辛酸和正癸酸，賦予了Sc發酵酒特有的酵母味，這與定量結果一致。與Sc純種發酵相比，混菌發酵提高了楊梅酒的果味強度，降低了發酵產生的酵母味和癸酸乙酯等帶來的澀味。

圖4 不同發酵方式下楊梅酒的感官評定雷達圖Fig. 4 Radar plots depicting the flavor profiles of Chinese bayberry wines produced by different fermentation methods

3 結 論

選用Io與Sc以10∶1的接種比例進行楊梅酒的混合發酵。混菌發酵增加了商業化釀酒酵母的發酵速率，使主發酵提早3 d完成。通過HS-SPME-GC-MS分析楊梅酒共檢測到59 種揮發性風味成分，其中含量較高的成分是辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇、反式石竹烯和2,3-環氧-4,4-二甲基戊烷。混菌發酵與Sc純種發酵相似度高，但減少了Sc發酵產生的辛酸及正癸酸這2 種不良氣味，也降低了Io產生的乙酸質量濃度；Io的參與使混菌發酵液中丁酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、3-壬烯酸乙酯等乙酯類和乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯等乙酸酯類含量分別提高了18.52%和57.34%，增加了楊梅酒的果香味。不同菌種發酵楊梅酒口味之間有顯著差異，果香和酸味是Io發酵酒最主要的風味，而Sc發酵酒有特有的酵母味，混菌發酵提高了楊梅酒的果味強度，降低了發酵產生的酵母味和癸酸乙酯等帶來的澀味。