HS-SPME-GC-MS 對傳統紅碎茶和CTC 紅碎茶揮發性化合物分析和比較

劉洪林，曾藝濤，趙 欣,*

（1.重慶第二師范學院，重慶市功能性食品協同創新中心，重慶市功能性食品工程技術研究中心，功能性食品研發重慶市工程實驗室，重慶 400067；2.重慶市輔仁中學校，重慶 400067）

紅茶的感官質量一般是由人們根據形狀、顏色、香氣、味道和葉底進行感官評價決定。在這些特性中，香氣是評價感官評分和對紅茶質量描述的一個重要指標。除了傳統的香氣質量感官評價外，氣相色譜-嗅覺測定法和香氣提取液稀釋分析也被廣泛應用于茶葉中氣味的描述和有效氣味的測定中[1-3]。但這些方法都依賴于訓練有素的專業人員，而且很可能受到個人和主觀因素的影響，如年齡、情緒和偏好。近年來，許多研究者利用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對紅茶進行客觀的鑒別和質量評價，并采用不同的揮發性化合物提取技術，如同時結合蒸餾-萃取和動態頂空固相技術[4-6]。然而，這些提取方法存在實驗過程耗時長，或樣品預處理復雜等問題。頂空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）已被證明是一種快速、簡單、方便的茶葉揮發性化合物分析方法[7-9]。該技術已成功應用于蘋果、草莓、番茄、橄欖油、綠茶等多種產品的質量評價和認證[7,10-12]。因此，研究這種方法作為鑒定和鑒別紅茶產品具有可行性的。由于香氣是食品最典型的特征之一，因此對香氣成分的表征可以成為評價感官質量的有效工具，可以用來鑒別其真偽[13-15]。實際上，芳香族成分代表了產品的化學“指紋”，因為在揮發性成分中所含化合物的性質和相對含量是產品的顯著特征。

HS-SPME與GC-MS相結合技術的化學計量方法在涉及食品的分類問題的文獻中被廣泛報道[16]，但鮮見對紅茶尤其紅碎茶進行研究。本實驗采用HS-SPME與GC-MS相結合的技術對紅碎茶揮發性成分進行表征，以區分該紅碎茶的加工方式壓碎撕裂卷曲（crush, tear and curl，CTC）紅碎茶和傳統加工（orthodox，OTD）紅碎茶。計算其揮發性化合物的萜烯指數，以區分紅碎茶的地理來源。以期為紅碎茶的香氣分析提供依據，并為紅碎茶加工方式提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

茶葉樣品：在不同地區的不同市場收集14 種不同的紅碎茶。2 個廣東紅碎茶：傳統加工紅碎茶（1號茶樣）和CTC加工紅碎茶（2號茶樣）；1 個安徽傳統加工紅碎茶（3號茶樣）；2 個湖南紅碎茶：傳統加工紅碎茶（4號茶樣）和CTC紅碎茶（5號茶樣）；3 個斯里蘭卡紅碎茶：English Breakfast-Orthodox（EW-O紅碎茶）（6號茶樣）；English Breakfast Teekanne-CTC（ET-C紅茶）（7號茶樣）和English Breakfast AHMAD-CTC（EH-C）紅碎茶（8號茶樣）；2 個海南紅碎茶：傳統加工紅碎茶（9號茶樣）和CTC紅碎茶（10號茶樣）；2 個四川紅碎茶：CTC紅碎茶（11號茶樣）和傳統紅碎茶（12號茶樣）；2 個云南紅碎茶：傳統紅碎茶1（13號茶樣）和傳統紅碎茶2（14號茶樣）。

實驗用化學試劑均為國產分析級試劑。

6890N-5973 GC-MS聯用儀 美國Aglient公司；SPME手持萃取柄及65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭 美國Supelco公司；FA2004A型分析電子天平 海津天電子儀器有限公司；DFT-200型200 g手提式粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；Mili-Q超純水儀 美國密理博公司；Centrifuge5810高速離心機德國Eppendorf公司；TU 1900型雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

分別稱取各紅碎茶樣品1 g（精確到0.001 g）于10 mL的頂空萃取瓶中，立即加入5mL蒸餾水，加蓋密封在電爐上加熱10 min。平衡后，將預先老化過的65 μm PDMS/DVB萃取頭迅速插入萃取瓶頂部，保持在90 ℃吸附30 min。取出后，每次分析前立即將PDMS/DVB萃取頭插入GC進樣口220 ℃進行5 min解吸附。每個樣本分析重復3 次[7,17]。

1.2.2 GC-MS測定條件

采用HP-5毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為純化氦氣（純度＞99.999%），恒定流速為1 mL/min。樣品提取后，萃取頭在GC進樣口220 ℃解吸5 min。起始柱溫50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至190 ℃，保持1 min，最后以20 ℃/min升至240 ℃，保持3 min，不分流進樣。

離子源溫度200 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；采用全譜掃描，用Xcalibur軟件[18]測定峰面積。用保留時間結合計算機譜庫檢索（美國Wiley和NIST庫）對揮發性化合物進行鑒定。然后計算萜烯指數。

1.3 數據統計分析

采用Excel和IBM SPSS Statistics V23.0軟件進行數據分析。茶葉樣品的萜烯指數計算方法為：

2 結果與分析

2.1 揮發性化合物測定結果

紅茶香氣主要為嫩香、甜香和花香等[19]。紅茶加工過程中，兒茶素類氧化形成的產物繼續氧化氨基酸、不飽和脂肪酸以及類胡蘿卜素，形成的醛、酮、酸類化合物為紅茶的主要香氣成分，主要包括：葉綠醇、香葉醇、香葉酸、芳樟醇及其氧化物、紫羅蘭酮、棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、茉莉酮甲酯、苯甲醇、2-苯乙醇、水楊酸甲酯等[19-24]。從圖1和表1可知，14 個不同地區不同類別的紅碎茶樣品中，共鑒定出59 種揮發性物質。結果表明，相對含量高于1%的揮發性化合物有11 種，分別為右旋檸檬烯、β-芳樟醇、順式-香葉醇、α-紫羅蘭醇、β-大馬酮、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、γ-紫羅蘭醇乙酸酯、六氫金合歡烯酰丙酮、棕櫚酸甲酯和葉綠醇。其中，葉綠醇是一種無環二萜醇，其相對含量最高，為0.5%～25.1%；其次是六氫金合歡烯酰丙酮，相對含量為0.52%～18.6%，金合歡醇丙酮相對含量為2.05%～5.65%；β-芳樟醇相對含量為0.44%～16.4%，β-紫羅蘭酮相對含量為3.07%～44.5%和α-紫羅蘭酮相對含量為0.44%～3.95%。在非萜類化合物中，相對含量較高的棕櫚酸甲酯相對含量為0.7%～10.51%，亞油酸甲酯相對含量為0.12%～7.16%等酯類化合物。其他化合物，如醛類中己醛相對含量為0.08%～0.59%，戊醛相對含量為0.02%～0.45%，苯乙醛相對含量為0.03%～0.77%等；醇類如糠醇相對含量為0.1%～3.77%等，相對含量均較低。結果表明，HS-SPME-GC-MS方法具有選擇性和敏感性，完全適合用于紅碎茶揮發性化合物的分析。

圖1 紅碎茶樣品中揮發性化合物的總離子流色譜圖Fig. 1 Typical total ion current chromatogram of volatile compounds in black tea sample

表1 14 種紅茶樣品中揮發性成分的HS-SPME-GC-MS分析Table 1 Volatile compounds detected in 14 black tea samples by HS-SPME-GC-MS

續表1

表2 主要香氣成分種類及含量統計Table 2 Statistics of the main aroma components and contents

許多研究已經對綠茶和紅茶的芳香族化合物進行的特征分析[25]。茶葉的典型香氣是歸因于大量的芳香族揮發性化合物，其性質和含量與前體風味成分（如氨基酸、脂肪酸、類胡蘿卜素等）、種植的地理區域、品種和加工工藝（如采摘、萎凋、發酵和干燥等）有關，從而每一個茶葉品牌都能確定其“指紋識別”[26]。由表2可知，紅碎茶樣品中最豐富的3 類揮發性化合物為萜烯類、酮類和酯類，其中萜烯類化合物占10.38%～60.34%，酮類物質占1.1%～22.09%，酯類物質占3.18%～41.83%。可見，樣品中萜烯類化合物是發現的最豐富的芳香化合物。此結果與前人研究紅茶香氣成分結果一致[19-24]。

CTC和OTD相比，CTC萎凋較輕。紅碎茶揉切后，與重萎凋葉相比，輕萎凋葉的發酵能力更強[27]。CTC滾子粉碎的茶葉比傳統滾子粉碎的茶葉發酵速度快。因此，由表1可知，同一地區的茶葉樣品中，CTC紅碎茶的揮發性醛類和醇類化合物的含量低于OTD紅碎茶；可能是由于輕萎凋葉的發酵更充分。而CTC紅碎茶酯類化合物的含量高于OTD紅碎茶，可能是由于發酵充分使醇類轉化成為酯類。但在2 個廣東紅碎茶樣品中，傳統紅碎茶中檢測到的揮發性化合物成分數量卻較高，OTD紅碎茶樣品中檢測到40 個揮發性化合物，CTC紅碎茶中卻檢測到30 個，這可能與重萎凋葉發酵速率低有關，導致OTD紅碎茶中醛類和醇類化合物等較多。OTD紅碎茶和CTC紅碎茶揮發性成分的差異可能會影響2 種類型紅碎茶的香氣特征。

2.2 萜烯指數分析

不同的茶樹品種在不同地理區域的栽培條件下以及在不同的加工和農藝處理條件下，芳樟醇和香葉醇的含量都存在較大差異。然而，每一個茶的品種都有一個特定的萜烯指數，只隨采摘方法的不同而變化，這一指標已被證明是茶葉品種鑒別的可靠統計工具[28]。由表2可知，萜烯指數的值只能在0～1之間，且不同地區生產的茶葉萜烯指數相差較大，只有湖南和斯里蘭卡、安徽和四川的紅碎茶之間萜烯指數相當。

由此可知，萜烯指數是專門針對茶葉品種的指數，不受加工方法的影響。然而，根據以往的研究，將萜烯指數作為化學分類標準存在一些問題[29]。首先，采摘標準對萜烯指數有影響。其次，萜烯指數在0～1之間的茶葉存在很多品種，這說明有些茶葉品種具有相同的萜烯指數，這一點從湖南和斯里蘭卡紅碎茶中萜烯指數可以看出。因此萜烯指數可作為茶葉產地鑒別的一種手段，但還缺乏精準性，需結合其他參數鑒定茶葉產品產地。

3 結論與討論

加工方法會改變茶葉的化學成分。本實驗比較了CTC和OTD技術對紅碎茶的影響，發現OTD技術通常比CTC技術生產的紅碎茶揮發性化合物成分更高。在不同加工方法的紅碎茶中共鑒定出59 種揮發性化合物，其中萜烯類化合物占10.38%～60.34%，酮類物質占1.1%～22.09%，酯類物質占3.18%～41.83%，這3 類化合物是其含量最豐富的化合物。結果表明，CTC紅碎茶中揮發性成分數量較低，醛類和醇類化合物含量較低，但酯類化合物含量高于OTD紅碎茶。不同地區生產的茶葉萜烯指數相差較大，只有湖南和斯里蘭卡、安徽和四川的紅碎茶之間萜烯指數相當，說明只用萜烯指數鑒別茶葉產地還缺乏精準性，其他參數需被結合應用鑒別和鑒定茶葉產品產地。

CTC紅碎茶是通過揉碎/切碎、撕裂和卷曲的特殊加工方式使茶葉破碎、細胞損傷，促進其內含物質的降解、轉化，形成區別于傳統紅碎茶的色澤和外形，具有獨特品質風格[30]。茶葉中的香氣依據嗅感不同主要有兩類，一類是嗅感為不愉快的青草類氣味，其主要的揮發性化合物為脂類物質降解產物，其中不飽和脂肪酸降解產物占90%以上[31]；另一類為愉快的花香、甜香、清香等香味，主要是由類胡蘿卜素、氨基酸和萜類化合物降解的揮發性化合物。CTC紅碎茶相較于OTD紅碎茶隨著茶葉由類胡蘿卜素、氨基酸和萜類化合物降解的揮發性化合物含量降低，但主體萜烯類的揮發性物質還在。同時，茶葉在細胞損傷、破碎，使得脂氧合酶作用于細胞膜脂，促使細胞膜中不飽和脂肪酸分離、分解[32]，產生醇、醛、酯類等揮發性成分[33]。CTC紅碎茶相較于OTD紅碎茶，不飽和脂肪酸前體物產生的揮發性化合物降低，其中醛類和醇類揮發性化合物含量大幅降低，但醛類揮發性化合物始終占茶葉中總醛類的70%以上。醛類揮發性化合物對總體風味影響巨大，低分子質量C4、C5醛通常具有愉快的香味，中等分子質量的醛（C6～C9）則具有清香、油香和脂香[34]，含量降低，茶葉甜味隨之下降，這一結果同感官審評的結果一致。這可能與茶葉中不飽和脂肪酸的含量有關，含量越低，其分解產物也降低。因此，對于紅碎茶的香氣前體物質不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、氨基酸和萜類化合物等的分析可作為以后研究的重點。