FOXC1、CXCR4和MMP-7在肺腺癌組織中的表達及臨床意義

葛紅艷，張正衛

(南京醫科大學附屬淮安第一醫院:1.檢驗科;2.病理科，江蘇淮安 223001)

肺癌是嚴重危害人類健康的呼吸系統惡性腫瘤，隨著工業的不斷發展和環境污染問題的日益惡化，肺癌的發病率在世界范圍內呈不斷上升趨勢；肺腺癌發病率較其他類型肺癌發病率低，腫塊生長緩慢，更容易漏診，大多數患者被診斷時已經為進展期肺腺癌，往往失去了根治性手術的機會[1-2]。近年來，除了不斷完善肺癌患者的治療外，尋求有效指導臨床診斷的腫瘤標志物也成了肺腺癌研究的熱點。本文分析了FOXC1，CXCR4及MMP-7在肺腺癌組織中的表達及意義，以期為肺腺癌病情嚴重程度的評估及預后判斷提供參考資料。

1 資料與方法

1.1一般資料 包含94對肺腺癌組織及對應癌旁組織的芯片購自上海芯超科技有限公司，有完整的臨床、病理資料，標本來源的患者男51例、女43例，年齡30～84歲，平均(62.2±9.9)歲，無淋巴結轉移者41例，有淋巴結轉移者53例。根據第8版TNM分期標準，Ⅰ期31例、Ⅱ期24例、Ⅲ期38例、Ⅳ期1例，手術時間2004年7月至2009年6月，隨訪5～10年，患者術前均未經過化學治療和放射治療。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 儀器：CX31奧林巴斯攝影顯微鏡(日本Olympus公司)。試劑：兔抗人FOXC1抗體(稀釋倍數1∶100)、CXCR4抗體(稀釋倍數1∶100)、MMP-7(稀釋倍數1∶100)和鼠抗兔二抗均購于Sigma公司，免疫組織化學試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2檢測方法 芯片經65 ℃烤片20 min后，使用二甲苯脫蠟，并用梯度乙醇脫水，經過5%的過氧化氫浸潤，放置于37 ℃濕盒中孵育20 min；經磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后放置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH值為6.0)中煮沸，自然冷卻1 h用于抗原修復，使用羊血清工作液封閉非特異性抗原，滴加一抗置于4 ℃ 冷庫中孵育過夜(每次實驗均用已知陽性片作陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照)，滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min；再滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈霉素卵白素，37 ℃孵育1 h，滴加二氨基聯苯胺(DAB)顯色。結果判讀：采用評分法，將染色強度和陽性細胞百分數結合進行評分。染色強度基本不著色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，黃褐色計為3分。組織芯片置于顯微鏡下計數200個細胞，陽性細胞百分數<10%計為0分；10%～40%計為1分；40%～70%計為2分；>70%計為3分。兩者相加0～2分評為陰性；3～6分為陽性[3]。所有免疫組化染色結果均采用雙盲法進行病理讀片。

1.3觀察指標 (1)比較腫瘤組織和癌旁組織FOXC1、CXCR4和MMP-7蛋白陽性率；(2)分析肺癌患者FOXC1、CXCR4和MMP-7蛋白陽性率與其病理參數(性別、年齡、EGFR狀態、腫瘤直徑、TNM分期)、轉移(淋巴結轉移)的關系及三個指標間的相關性；(3)分析肺癌患者FOXC1蛋白陽性率與患者預后的關系。

1.4統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件處理數據，組織蛋白表達與患者臨床病理參數分析采用Pearson卡方檢驗進行分析，蛋白之間相關性采用Spearman等級相關分析，使用Kaplan-Meier法評估患者累積生存期，組間生存期的比較采用Log-Rank法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1腫瘤組織和癌旁組織FOXC1蛋白、CXCR4蛋白和MMP-7蛋白陽性率情況比較 FOXC1、CXCR4和MMP-7在肺腺癌組織中的陽性表達率(分別為67.4%、55.8%和53.2%)明顯高于相應癌旁組織(分別為11.6%、14.0%和10.5%)，差異有統計學意義(P<0.001)，見表1、圖1。

2.2肺腺癌組織中FOXC1、CXCR4、MMP-7表達與臨床病理特征關系分析 EGFR陽性、腫瘤直徑T3～T4、淋巴結轉移陽性和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者的FOXC1陽性率更高(P<0.05)；EGFR陽性、淋巴結轉移陽性和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者的CXCR4和MMP-7陽性率更高(P<0.05)；FOXC1的陽性率與患者的性別、年齡無關，CXCR4的陽性率與患者的性別、年齡和腫瘤直徑無關，MMP-7的陽性率與患者的年齡、腫瘤直徑無關(P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理參數的患者FOXC1、CXCR4、MMP-7陽性率的比較[n(%)]

表2 不同臨床病理參數的患者FOXC1、CXCR4、MMP-7陽性率的比較[n(%)]

注：A為FOXC1蛋白在肺腺癌組織中的表達(SP ×200)；D為FOXC1蛋白在癌旁組織中的表達(SP ×200)；B為CXCR4蛋白在肺腺癌組織中的表達(SP ×200)；E為CXCR4蛋白在癌旁組織中的表達(SP ×200)；C為MMP-7蛋白在肺腺癌組織中的表達(SP ×200)；F為MMP-7蛋白在癌旁組織中的表達(SP ×200)

2.3FOXC1表達情況與肺腺癌患者預后情況分析 對94例肺腺癌患者進行預后隨訪，肺腺癌組中的FOXC1蛋白表達陽性患者的累積生存率為5.2%(3/52)，低于FOXC1表達陰性患者的58.3 %(21/36)，差異有統計學意義(χ2=28.57，P<0.001)，見圖2。單因素分析見表3。此外，多因素Cox回歸分析顯示，肺腺癌組織中FOXC1的表達是肺腺癌預后不良的獨立危險因素[相對風險比(RR)=4.351，95%CI：2.417～7.834，P<0.001]。

圖2 FOXC1蛋白不同表達患者的生存函數圖

表3 肺腺癌患者預后因素的單因素分析

注：RR表示相對風險比

2.4肺腺癌組織中FOXC1蛋白、CXCR4蛋白和MMP-7蛋白表達之間的相關性分析 采用Spearman等級分析方法對FOXC1蛋白、CXCR4蛋白和MMP-7蛋白表達之間的相關性進行分析，結果顯示，FOXC1與CXCR4和MMP-7均呈正相關，差異有統計學意義(r=0.455、0.577，P<0.001)。

3 討論

人類叉頭盒(FOX)基因家族共有一個進化上保守的“叉頭”或“翼-螺旋”DNA結合域，由40多個進化上保守的轉錄調節因子組成。FOX蛋白在多種生理病理過程如細胞增殖、分化和凋亡中起到重要作用[2]，并且FOX蛋白的失調控與發育障礙或腫瘤密切相關[4]。FOXC1是FOX轉錄因子家族的成員，之前已有研究報道FOXC1在乳腺癌、肝癌、胃癌的發生、發展中起到重要作用[5-7]，比如FOXC1可以通過調節MMP7促進基底樣乳腺癌(BLBC)的侵襲性并且可以作為BLBC預后不良的標志物。本研究結果也顯示，肺腺癌組織中FOXC1的表達明顯高于癌旁組織，表明FOXC1可能參與肺腺癌的發生，其異常高表達可能導致肺腺癌組織上皮細胞過度增殖或突變，從而形成腫瘤。肺腺癌中FOXC1的表達與腫瘤的直徑相關，腫瘤組織中FOXC1表達越高，腫瘤直徑越大，結合以往報道FOXC1在子宮內膜癌和宮頸癌中促進腫瘤細胞增殖[8-9]，推測FOXC1也同樣與肺腺癌增殖相關；FOXC1的表達越高，腫瘤越趨于淋巴結轉移，同時FOXC1與轉移相關蛋白CXCR4和MMP-7呈正相關，結合以往報道FOXC1在多種腫瘤如食管癌、胰腺癌和胃癌中促進腫瘤轉移[2,7,10]，FOXC1可能也具有促進肺腺癌細胞轉移的功能；FOXC1的表達越高，TNM分期越高，以上結果提示FOXC1促進了肺腺癌的發展。

雖然近年來肺腺癌患者總體生存時間不斷提高，但是在接受標準化治療后，部分肺腺癌患者仍然會發生局部復發和遠處轉移，直接影響了患者的壽命，這突出了肺腺癌患者預后評估的重要性。生存分析結果表明，FOXC1高表達的肺腺癌患者總體生存率較FOXC1低表達患者明顯縮短。肺腺癌組織中FOXC1的表達是患者總體生存率的獨立危險因素，提示FOXC1在肺腺癌中同樣可以作為預后標志物，其高表達提示肺腺癌患者預后不良。

CXCR4屬于跨膜G蛋白偶聯受體，同時也是基質衍生因子-1的天然受體(SDF-1)[11-12]，在包括非小細胞肺癌、胃癌、乳腺癌和結腸癌在內的多種腫瘤中高表達[13-16]，CXCR4促進上皮間質轉化(EMT)過程，在腫瘤轉移中起到重要作用[17-19]，基質金屬蛋白酶(MMPs)屬于鋅依賴性同源蛋白酶家族，能夠降解大多數細胞外基質(ECMs)。作為MMPs重要成員，MMP-7同樣具有基質蛋白酶功能，在腫瘤遷移中起到關鍵的作用[20-21]。本研究發現，CXCR4和MMP-7在肺腺癌組織中高表達，并且FOXC1的表達與CXCR4和MMP-7均呈正相關，結合以往報道，推測FOXC1可能通過調控CXCR4和MMP-7促進肺腺癌的發生發展，但是肺腺癌中三者是否存在調控關系需要進一步實驗驗證。

4 結論

肺腺癌組織中FOXC1蛋白、CXCR4蛋白和MMP-7蛋白表達水平高于癌旁組織，且其表達水平與患者臨床病理參數及轉移存在密切關系，FOXC1可以作為肺腺癌患者預后不良的標志物，臨床可將其作為治療靶點開展進一步研究。