基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜臨床檢測微生物的專利及行業發展分析

曹克浩，吳文英，葛永奇

(國家知識產權局專利局復審和無效審理部，北京 100088)

臨床上檢測微生物是一個復雜的過程。當患者疑似微生物感染時，臨床醫生需要收集其流行病學信息、癥狀和體征，并及時采集患者樣本(如血液、尿液、痰等)送微生物實驗室進行鑒定。目前病原菌的鑒定方法主要包括表型鑒定法和基因型鑒定法。前者需要對樣本進行培養、分離，檢測周期長且操作繁瑣，已經不適合快速鑒定致病微生物的臨床需要。后者通過分子生物學方法將細菌的檢測與鑒定引入核酸和蛋白質等大分子水平，雖然準確率高，但操作復雜，成本昂貴，易受干擾物影響[1]。因此，快速而高效的微生物診斷技術對于確定患者治療方案、緩解患者病痛至關重要。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI TOF MS)檢測微生物技術是近年來發展起來的鑒定病原微生物的新技術，可通過對供試病原微生物的生物活性分子的指紋圖譜進行同源分析而快速鑒定菌種，對疾病診斷具有重要意義[2]。MALDI TOF MS檢測微生物主要是利用已知的菌種建立數據庫，通過對待測微生物進行檢測，獲得蛋白質或核酸特征指紋圖譜，再將所得的質譜圖與數據庫中的微生物參考圖譜進行比對，從而得到鑒定結果。因此，與傳統病原微生物鑒定方法相比，MALDI TOF MS技術具有靈敏度較高、準確率較高、耗能較低、高通量等優點。

目前國際上使用較為廣泛的MALDI TOF MS的主要生產商有德國布魯克公司、法國梅里埃公司、日本島津公司等。截至2019年2月19日，全球涉及MALDI TOF MS質譜儀及其部件的相關專利申請已經達到2 269件(同族專利擴展為10 396件)，其中中國受理的專利申請為399件(數據來自國家知識產權局專利檢索系統、DWPI數據庫、CNABS數據庫)。雖然國內已有北京東西分析、北京普析通用、江蘇天瑞、舜宇恒平、聚光科技、鄭州安圖、北京毅新、廈門質譜等企業提交了一系列涉及質譜儀產品的專利申請[3]，但這些專利申請多是基于上述國外生產商的產品及其部件進行改進，原創型專利數量過少，在相關技術的推廣應用中易于受到國外產品專利的限制。

根據中華檢驗醫學網的預測，未來的臨床微生物檢測的市場空間將達到400億元[4]。鑒于MALDI TOF MS臨床上檢測微生物的潛在應用價值，可以預期相關檢測技術和產品(例如檢測試劑、芯片、載體、指紋圖譜庫或質譜模型、分析軟件及試劑盒等)即將成為專利申請的熱點。因此，在全球范圍內分析MALDI TOF MS臨床上檢測微生物的專利申請進展，可以了解相關檢測技術和產品的創新現狀和發展趨勢，對于我國在該領域上繞開質譜儀器專利的限制而實現“彎道超車”提供指導作用。

1 專利分析的數據來源

本文以國家知識產權局收錄的德溫特世界專利索引數據庫(DWPI)和中國專利文摘數據庫(CNABS)為數據來源，利用關鍵詞檢索式“MALDI”“time s flight s mass s spectrometry”“matrix assisted laser desorption / ionization”“ CLIN-TOF”，結合“Microbe or microb+ or microorganism+”“bacil+(= bacilus or bacillus or bacilli) or bacter+(= bacteria or bacterial or bacterium)”“germ or microphyte or pathogen+，fung+(=fungi or fungus or fugal)”“virus”，截至2019年2月13日，共得到涉及MALDI TOF MS技術檢測微生物的508件專利(同族專利擴展為2 750件專利)。在分析大量文獻的基礎上，從上述結果中篩選和去除主要發明目的在于改進質譜儀裝置、部件以及用于診斷非微生物病癥的數據，共獲得發明主題涉及上述檢測技術和產品的279件專利申請，其中以中國作為受理國的專利申請共122件，包含中國申請人提交的83件專利。所有結果導入數據分析的專業平臺進行分析。

此外，以主題關鍵詞“MALDI”“ time s flight s mass s spectrometry”“ matrix assisted laser desorption / ionization”“ CLIN-TOF結合分類號G01N”進行檢索，共得到涉及MALDI TOF MS技術的2 269件專利(同族專利擴展為10 396件專利)，其中以中國作為受理國的專利申請為399件。

雖然中國專利申請的公開周期普遍短于國外專利申請的公開周期，但國外專利申請到公開通常有18個月周期，因此2018年的數據僅供參考。

2 涉及MALDI TOF MS臨床檢測致病微生物的專利申請分析

2.1專利申請趨勢分析 圖1顯示了世界范圍及中國范圍內MALDI TOF MS臨床檢測微生物的專利逐年申請情況。從圖1中可以看出，該技術從1996年首次出現專利申請后，之后呈緩慢增長的態勢，其中申請人以外國申請人為主。進入2008年之后，中國范圍內提交的專利申請呈現快速增長的態勢，并逐漸縮小與世界范圍內專利申請的數量差距，尤其是2016-2018年，雖然二者的申請數量均不高，但申請數量差距達到最小值。這初步表明國外申請人尚未重視將MALDI TOF MS臨床檢測微生物的技術提交專利申請，而中國已經成為將該檢測技術提交專利申請的主要國家。

圖1 世界范圍及中國范圍的專利逐年申請情況

2.2技術來源國的專利申請趨勢分析 圖 2 、3分別為世界范圍內、中國范圍內提交專利申請的主要國家及地區。雖然美國在世界范圍內的專利申請數量最多，但其進入中國的專利申請僅位居第二。事實上加上中國臺灣的申請量，中國申請人提交的專利申請數量已經位居世界第一。這表明，相比于以中國作為受理國的申請量(399件)占世界范圍內涉及所有MALDI TOF MS技術的專利申請量(共2 269件)的較小比例而言，中國申請人在臨床檢測微生物的專利申請已經超過外國申請人，進一步表明國外申請人并未重視MALDI TOF MS技術臨床檢測微生物在中國的市場前景，這意味著無論是從研究的角度，還是市場運營的角度，對于中國申請人都是難得的科學研究與專利保護的“窗口期”。

2.3專利申請人的申請趨勢分析 圖4顯示世界范圍內MALDI TOF MS臨床檢測微生物的主要專利申請人的數量排名。數據顯示，國外申請人中，德國布魯克公司、法國梅里埃公司、美國安捷倫公司作為MALDI TOF MS儀器的核心技術的擁有者，對于臨床檢測微生物的應用技術也給予一定的關注；知名的國際生物儀器及試劑公司，如美國BD公司、美國ISIS制藥公司、美國西昆諾姆公司，也開始涉及質譜臨床檢測微生物的應用中。然而，同樣作為MALDI TOF MS儀器的核心技術的擁有者，日本島津公司(含在中國的合資企業)并未提交MALDI TOF MS臨床檢測微生物的專利申請。

國內申請人中，北京毅新(含北京毅新博創公司、北京毅新興業公司)的專利申請及授權數量遠遠超過其他國內申請人和國外申請人，這表明該公司在該研究領域已經處于壟斷地位。擔負傳染病預防和檢疫職責的中國疾控中心亦已經開始使用質譜用于臨床診斷致病微生物。而較早研究和開發MALDI TOF MS儀器的廈門質譜、浙江和譜、鄭州安圖，亦開始涉及臨床診斷微生物的研究和應用。這表明我國在該領域的主體并不是以研究機構為主，已經涌現出以北京毅新為代表的企業積極參與技術轉化，并在該領域的專利布局中與國外申請人保持同步、甚至超越，保持均衡的態勢。

圖2 世界范圍內提交專利申請的國家及地區(前10名)

圖3 中國范圍內提交專利申請的主要國家及地區

圖4 世界范圍內主要申請人的專利申請數和授權數排名

2.4MALDI TOF MS臨床檢測微生物的特征標志物的專利分析 微生物包括細菌、病毒、真菌和酵母菌等。針對微生物的特征標志物主要是具有生物活性的蛋白質和核酸。從分子生物學的角度看，由于核酸(基因)決定蛋白的表達，而蛋白質的表達決定生物體的表型。因此，通常認為基于蛋白質指紋圖譜進行的微生物鑒定分析，相比核酸水平進行的鑒定更為準確和便捷[5]。在專利分析中，以蛋白或多肽作為待檢特征標志物的專利分類號IPC小組為C07K，以核酸或基因作為鑒定標志物的專利分類號IPC小組為C12N。

然而， 以世界范圍的專利申請(279件)的分類號C07K、C12N(包括主分類號、副分類號)進行分析，結果顯示：涉及分類號C07K的專利申請數量(共101件)與涉及分類號C12N的專利申請數量(共178件)，二者比例接近4∶7。這表明，目前使用MALDI TOF MS技術用于臨床鑒定微生物，已經越來越傾向于以微生物的核酸或基因作為待檢特征標志物。這種變化主要與MALDI TOF MS聯合PCR擴增技術的檢測技術取得突破發展有關。該技術或是使用通用引物擴增微生物16S rDNA后，通過特定核酸內切酶將擴增產物酶切成長度不一、豐度不一的核酸片段，然后進行激光質譜獲得待測微生物的核酸指紋圖譜；或是聯合多重PCR技術擴增微生物的核酸目的基因，然后將擴增的目的基因片段經質譜檢測后的峰圖與數據庫中的峰圖進行比對后得出鑒定結果[6]。

此外，利用MALDI TOF MS檢測核酸標志物，還具有雙保險的特點，一旦有序列發生變化，質譜就可以發現變化的產物，可以是峰的遷移或是出現新的質譜峰，抑或是理論值峰的消失，因此特別適用于檢測耐藥性突變位點、微生物分型。甚至有報道使用該技術轉用于檢測生物組織SNP位點、甲基化分型、產前診斷中的胎兒游離循環DNA，這都預示著MALDI TOF MS技術中選擇核酸作為特征標志物，相比于選擇蛋白作為特征標志物，將具有更為廣泛的應用前景[7]。

2.5MALDI TOF MS臨床檢測微生物的專利申請的授權情況分析 圖5顯示世界范圍內MALDI TOF MS臨床檢測微生物的專利申請狀態。其中授權的專利申請數量為84件，占總數30%。未授權(包括駁回、主動撤回、視為撤回)的專利申請數量為46件，占總數17%。在審案件(包括處于申請公開、進入實質審查)的案件為149件，占總數53%。通過比較，授權的比例明顯超過未授權的比例，說明MALDI TOF MS臨床檢測微生物的技術具有較高的可專利性，這與該技術受到臨床檢驗人員的認可保持一致。

然而，根據專利法第25條第1款的規定，對于疾病的診斷和治療方法不能獲得專利權。同時，《專利審查指南》第二部分第一章第4.3.1.1節“屬于診斷方法的發明”指出，“如果一項發明從表述形式上看是以離體樣品為對象的，但該發明是以獲得同一主體疾病診斷結果或健康狀況為直接目的，則該發明仍然不能被授予專利權”[8]。雖然MALDI TOF MS用于臨床鑒定微生物的發明方法，從表述形式上看是以離體致病菌樣品為對象的，但該發明方法是以獲得同一主體(即患者)疾病診斷結果或健康狀況為直接目的，因此，對于這類方法的發明主題不能被授予專利權。

因此，對授權專利的發明主題進行分析可知，如圖6顯示，一方面，發明主題涉及檢測微生物方法的授權專利(共13件)全部為用于鑒定微生物耐藥性的專利，具體是通過MALDI TOF MS 技術分析抗菌藥物及被修飾后的產物、分析給藥后待測細菌的代謝物、分析微生物的核糖體DNA 甲基化、分析微生物的突變位點等。這種對致病微生物的耐藥性機理的保護，由于不能以產品的形式進行運營，難以引起資本市場的興趣。同時在專利侵權鑒定過程中難以認定被控侵權的方法是否落入專利的保護范圍，因此該類主題的授權專利難以獲得有效的專利運營和市場保護。

圖5 世界范圍內MALDI TOF MS臨床檢測微生物的專利申請狀態

圖6 授權專利的發明主題

另一方面，發明主題涉及核酸引物組試劑盒的專利為27件，蛋白標志物試劑盒的專利為17件，涉及對鑒定核酸或蛋白標志物中改進所用載體、基質及試劑的專利為24件。由此可見，通過提交涉及核酸和蛋白標志物的試劑盒的專利申請，既有利于獲得專利授權，同時能夠間接地保護MALDI TOF MS臨床檢測微生物的用途。此外，改進上述試劑盒中所用的載體(如承載蛋白或核酸樣品的芯片載體、靶托)、基質(用于匹配樣品點樣的基質溶液)、試劑(如樣品預處理試劑等)也具有較高的可專利性?？梢灶A期這類發明主題的專利更會受到市場的認可，同時也為研究人員的技術開發提供指導作用。

3 結論與建議

3.1結論 本文通過國家知識產權局收錄的德溫特世界專利索引數據庫(DWPI)和中國專利文摘數據庫(CNABS)，從世界及中國范圍的專利申請趨勢、技術來源國、專利申請人的分布、檢測特征標志物、專利授權情況、授權的發明主題類型等方面對全球MALDI TOF MS臨床檢測致病微生物的研究現狀和發展態勢進行了專利信息分析。

研究表明：(1)涉及研發和生產MALDI TOF MS產品及其部件的核心技術仍然掌握在美、日、德等國，國內并未出現類似于類型布魯克公司和英國質譜公司這類型的大型質譜研發和生產企業[9]；(2)當前國外MALDI TOF MS質譜研發企業的研究熱點包括離子源、離子阱、離子導入裝置、真空泵、寬動態范圍以及微通道板為主的電子倍增器[10]，對于使用該技術用于臨床檢測致病微生物的應用并未引起重視，因而在專利申請和授權數量上并未占據優勢。(3)相比于國外的MALDI TOF MS質譜儀器的企業，國內相關企業已經形成利用該技術應用于臨床檢測致病微生物的趨勢，并涌現以北京毅新為代表的國內科技創新企業進行專利布局，其中無論是申請數量還是授權數量，已經能與國外企業形成均衡態勢。(4)該領域的研究成果中，對于發明主題涉及涉及核酸和蛋白標志物的試劑盒以及載體、基質、試劑的專利申請，既有利于獲得授權，同時在專利運營過程中具有較低的生產成本和診斷準確率高的優點，易于獲得市場認可。因此，在國外MALDI TOF MS產品的專利技術壟斷的情況下，屬于難得的專利申請空白，值得國內科技創新企業引起關注。

3.2建議 為全面貫徹十九大報告提出的“實施健康中國戰略”的精神，同時響應“中國制造 2025”的發展規劃，堅持創新驅動、智能轉型、強化基礎、綠色發展，加速我國在應用MALDI TOF MS臨床診斷新技術的發展，為人民群眾提供全方位全周期的健康服務，可以從以下幾方面進行努力。(1)鼓勵國內企業和科研院所利用我國臨床樣本資源豐富的優勢，積極投入MALDI TOF MS臨床診斷致病微生物的研究，不斷提高自身的技術創新能力，研發一系列針對中國人特有的微生物病癥的診斷技術，并積極申報專利申請，實現專利保護。(2)國家及地方政府在科研政策、市場采購、專利資助、知識產權保護等方面出臺相關政策，以鼓勵國內申請人積極搶占技術制高點，推進診斷技術的創新，為將來國外專利進入中國診斷市場而提前做好準備。(3)國內企業和科研院所要不斷努力拓展MALDI TOF MS臨床診斷致病微生物的新領域，并根據中國現階段的國情，例如微生物對環境和食品安全的影響的檢測需要，積極研發和申報關于非診斷目的的檢測微生物的專利方法申請，從而獲得更為全面的專利保護力度。(4)根據該技術需要大樣本的微生物標準指紋質譜圖譜數據的特點，利用互聯網將眾多醫院、檢疫機構的微生物標準數據樣本進行共享，并通過大數據技術進行處理分析，從而研發出一系列“互聯網+”的質譜診斷技術和相關產品，并積極進行國內外專利布局，以實現我國在該診斷領域中“彎道超車”。(5)在承接成熟的MALDI TOF MS質譜診斷微生物的基礎上，將實驗數據的處理分析與人工智能結合，形成MALDI TOF MS智慧質譜(即MALDI TOF MS智譜)診斷微生物技術。該智譜技術極大提高了譜圖穩定性與譜庫分辨率，并智能讀取質譜產生的數據并做出判定，實現了效率的極大提升，大量節省了醫療成本[11]。