加味芎蝎散對咳嗽變異性哮喘大鼠氣道黏膜上皮連接相關蛋白表達的影響?

楊 斌 李 燕 林美嬌 徐榮謙 方順順 楊冬妹 孫洮玉△

（1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

咳嗽變異性哮喘（CVA）是以咳嗽為唯一癥狀的特 殊類型哮喘。調(diào)查顯示，CVA發(fā)病率約占兒童慢性咳嗽的41.95%［1］，為兒童咳嗽的常見病因。據(jù)報道30%的CVA患兒會轉變?yōu)榈湫拖?］。CVA發(fā)病機制復雜，研究表明可能與遺傳、解剖、免疫、炎癥等多種因素有關［3］。近年來發(fā)現(xiàn)，上皮屏障功能的減退是引起CVA發(fā)生的高危因素［4-5］，因此，增強上皮細胞表面連接是防治CVA有效措施。加味芎蝎散是本文作者徐榮謙教授的經(jīng)驗方，臨床應用效果顯著，能夠降低氣道炎癥，改善通氣，降低復發(fā)發(fā)生率［6-7］。本研究擬通過觀察加味芎蝎散對CVA大鼠肺泡灌洗液炎細胞及肺組織形態(tài)學的影響，觀察細胞連接相關蛋白在大鼠支氣管黏膜上皮的表達情況，研究中藥對CVA的防治機理，并探索加味芎蝎散對支氣管黏膜組織的可能作用靶點。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量220～250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001。動物適應性飼養(yǎng)3 d，自由進食標準大鼠飼料，自由飲水和攝食，自然光照，室溫（22±2）℃，濕度（40±10）%。

1.2 試藥與儀器 1）藥物：中藥加味芎蝎散，組成：川芎5 g，全蝎3 g，蘆根20 g，蓽茇1 g，半夏5 g，細辛1 g，五味子10 g，白前10 g（北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供），用中藥煎藥機煎制，制成煎劑，含生藥量3 g/mL。按大鼠體表面積換算，大鼠給藥劑量為0.5 g/（kg·d）。孟魯司特鈉片（杭州默沙東公司生產(chǎn)，規(guī)格4 mg/片，批號H37021289），取藥片溶于蒸餾水中，配制質量濃度2 g/mL。卵蛋白OVA（美國Sigma公司，批號A5253-1009），Al（OH）3凝膠（美國Sigma公司，批號A8222-250）。2）試劑：白介素-33（IL-33）、胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）試劑盒（美國 R&D Systems公司），E-cadherin抗體（英國abcam公司，貨號ab76055），緊密連接蛋白（ZO-1）（英國abcam 公司，貨號ab221547），Claudin3抗體（英國abcam公司，貨號ab15102），PV6000免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司），HRP標記二抗、ECL發(fā)光液顯色（北京普利萊科技有限公司）。3）儀器：Olympus BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）；Image-Pro Plus 6.0軟件（美國Media Cybernetics公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 分組及造模 將40只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組10只與造模組30只。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)文獻報道［8］及研究者既往造模經(jīng)驗建立CVA模型。具體方法如下：造模組首日肌注2%OVA 1 mL，腹腔注射20%Al（OH）31 mL，從第3周起，超聲波霧化器內(nèi)1%OVA溶液攻擊。每日1次，持續(xù)1周。當大鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹肌收縮、咳嗽等形態(tài)學改變，確定造模成功；外周血中嗜酸性粒細胞百分比顯著高于空白對照組亦證明造模成功。30只造模組大鼠隨機分為模型組、孟魯司特鈉組以及中藥組，每組10只。

1.4 給藥方法 空白對照組與模型組以蒸餾水10 mL/（kg·d）灌胃，孟魯司特鈉組灌胃藥液10 mg/（kg·d），中藥組灌胃中藥液50 g/（kg·d），每日1次，共4周。各組大鼠均于末次給藥后收集腹主動脈血，頸部脫臼法處死，快速取出肺組織，左肺放入中性甲醛液中固定48 h待包埋，右肺下葉組織，約400 mg放入-70℃超低溫冰箱凍存。

1.5 標本采集與檢測 1）ELISA法檢測肺組織中TSLP、IL-33的含量：取20 mg左右凍存肺組織，加人200 μL生理鹽水低溫勻漿1 min，2次離心后，取上清得勻漿液，BCA試劑盒檢測濃度，配制標準曲線，加樣孵育、洗滌，酶標抗體TSLP、IL-33孵育、洗滌，加HRP底物液顯色，終止反應后，450 nm處檢測吸光度。2）各組大鼠肺組織病理學觀察：中性甲醛液固定左肺上葉組織48 h，脫水、石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學變化。3）免疫組化法測定E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達：左肺上葉組織石蠟包埋，4 μm切片，烘箱70℃烤片1 h，二甲苯、梯度乙醇脫蠟，3%的過氧化氫避光10 min以滅活內(nèi)源性酶；枸櫞酸鹽修復液（pH6.0）高壓熱修復3 min；滴加ZO-1、E-caderin、Claudin3抗體（濃度分別為1∶100，1∶400，1∶200），4 ℃冰箱孵育過夜滴加辣根過氧化物酶標記的IgG抗體（二抗），常溫孵育30 min，DAB顯色，鏡下控制反應時間，顯色后自來水洗，蘇木素復染，透明，封片。光鏡下觀察，陽性為支氣管黏膜上皮胞膜棕黃色顆粒，胞漿亦有少量表達，陰性對照用PBS代替一抗，每張切片隨機取5個高倍視野（400倍），Image-Pro Plus 6.0測定陽性信號的積分光密度（IOD）值。4）Western blotting測定E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達。冰上裂解右肺下葉組織約50 μg，勻漿器勻漿，BCA法測定各樣本的蛋白濃度，根據(jù)濃度計算并調(diào)整樣本為統(tǒng)一蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠和分離膠均為10%，濕法轉PVDF膜，轉膜后室溫封閉，之后孵育相應ZO-1、E-caderin、Claudin3一抗，濃度均為1∶1000，4℃孵育過夜，次日PBS-T清洗后，孵育HRP標記的第二抗體1 h，ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)化學發(fā)光成像，保存數(shù)據(jù)為圖片，應用Quantity One對條帶進行分析，用GAPDH為內(nèi)參，以比值結果作為目標蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織中細胞因子表達水平 見表1。模型組大鼠肺組織中細胞因子IL-33、TSLP的含量均高于空白對照組，而中藥組和孟魯司特鈉組可以明顯抑制肺組織中IL-33、TSLP的上升。中藥組與孟魯司特鈉組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肺組織中細胞因子表達水平比較（ng/mL，±s）

表1 各組大鼠肺組織中細胞因子表達水平比較（ng/mL，±s）

與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別空白對照組模型組孟魯司特鈉組中藥組n IL-3328.75±4.5447.63±6.80△△39.25±5.54*36.87±4.83**TSLP 115.52±17.80170.64±21.32△△148.66±23.53*143.33±20.49*

2.2 各組大鼠肺組織病理改變 見圖1?？瞻讓φ战M支氣管、肺泡腔、間質及血管均未見明顯炎癥浸潤，支氣管管腔內(nèi)未見分泌物，黏膜皺襞及黏膜上皮形態(tài)未見異常。模型組肺組織內(nèi)多量炎細胞浸潤，黏膜上皮層纖毛柱狀上皮細胞變性、脫落，黏膜皺襞變平，管腔內(nèi)可見黏液栓。孟魯司特鈉組以及中藥組可有模型組的表現(xiàn)，但較模型組均有明顯的減輕表現(xiàn)。

圖1 各組肺組織病理學改變（HE染色，100倍）

2.3 各組大鼠支氣管黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的免疫組化比較 見表2，圖2～4。E-caderin、ZO-1、Claudin3在氣道黏膜上皮、部分氣道平滑肌、血管平滑肌及個別肺間質中呈胞膜及胞漿上棕黃色表達，本次實驗僅觀察并統(tǒng)計氣道黏膜上皮組織染色。空白對照組中E-caderin、ZO-1、Claudin3表達較高，呈強陽性表達，而在模型組中呈弱陽性表達，表達量明顯減低（P＜0.01）。與模型組比較，孟魯司特鈉組和中藥組表達明顯增強（P＜0.05），但均弱于空白對照組。中藥組與孟魯司特鈉組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠氣道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達比較（IOD，±s）

表2 各組大鼠氣道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達比較（IOD，±s）

組別空白對照組模型組孟魯司特鈉組中藥組n E-caderin 25.35±2.7710.45±3.23△△18.35±3.09*17.59±2.46**ZO-122.65±6.859.21±2.48△△17.35±2.56*19.08±2.82*Claudin323.45±2.6912.69±2.86△△18.92±3.09*18.29±2.37*

圖2 各組E-cadherin免疫組化（100倍）

圖3 各組ZO-1免疫組化（200倍）

圖4 各組Claudin3免疫組化（200倍）

2.4 各組大鼠支氣管黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Cla-udin3蛋白表達比較 見表3，圖5?？瞻讓φ战M中E-caderin、ZO-1、Claudin3表達強度高，而在模型組中表達量明顯減低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，孟魯司特鈉組和中藥組表達量均有不同程度的增高（P＜0.05）。中藥組與孟魯司特鈉組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠氣道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達比較（目標蛋白/內(nèi)參GAPDH，±s）

表3 各組大鼠氣道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達比較（目標蛋白/內(nèi)參GAPDH，±s）

組別空白對照組模型組孟魯司特鈉組中藥組n E-caderin 0.81±0.070.68±0.08△0.75±0.09*0.74±0.06*ZO-10.80±0.060.62±0.08△△0.73±0.09*0.72±0.11*Claudin30.85±0.070.59±0.06△0.70±0.11*0.77±0.11**

圖5 各組肺組織E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表達

3 討論

CVA是目前兒科領域較受關注的常見疾病，近年來隨著霧霾的加重，PM2.5的暴升，CVA在我國兒童的發(fā)病率呈急劇上升趨勢，除了發(fā)病率高，易轉化為典型哮喘外，最新研究發(fā)現(xiàn)，CVA患兒比典型哮喘更易出現(xiàn)情緒低落、焦慮、抑郁等心境變化［9］，嚴重影響著患兒及其家庭的生活質量。因此，探索CVA潛在發(fā)病機制，開創(chuàng)有效的治療策略，有著積極而重要的臨床意義和社會意義。

CVA為Th1/Th2免疫失衡，Th2炎癥反應占優(yōu)勢的氣道免疫炎癥性疾?。?0］。在變應原和病原微生物的刺激下，氣道上皮細胞損傷后可釋放多種細胞因子和炎性介質，其中，細胞因子IL-33和TSLP是CVA Th2型炎癥反應啟動的重要因素［11］。來源于上皮的細胞因子IL-33和TSLP可促進下游樹突狀細胞OX40L與CD4+T細胞膜上的OX40結合，使得CD4+T細胞向Th2亞群分化，上調(diào)Th2細胞因子的比例，增強Th2型免疫應答［12-13］。本次研究通過ELISA法檢測肺組織中IL-33和TSLP的含量，發(fā)現(xiàn)CVA模型組氣道組織IL-33和TSLP明顯升高，而中藥組可以顯著抑制IL-33和TSLP的表達，且與模型組之間差異具有統(tǒng)計學意義；提示加味芎蝎散可能通過抑制Th2型細胞因子IL-33和TSLP的表達，緩解下游的免疫炎癥反應。

上皮連接功能減弱或喪失是氣道上皮損傷的重要原因之一，E-caderin、ZO-1、Claudin3是發(fā)揮上皮屏障功能的重要細胞間連接蛋白。E-caderin是一類鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，作用是保持上皮細胞間的粘附狀態(tài)，維持組織完整。既往研究表明，E-caderin在大多數(shù)炎癥中的表達均呈下調(diào)趨勢。近年來研究發(fā)現(xiàn)，E-caderin在哮喘患者及大鼠模型中的表達均明顯降低［14-15］，說明E-caderin可能與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展有關聯(lián)。ZO-1和Claudin3等構成緊密連接蛋白復合物，在哮喘中亦表達下調(diào)。大量研究推測了連接蛋白對于哮喘發(fā)生及進展可能的機制：上皮連接蛋白表達下降后，上皮連接功能受損，支氣管上皮細胞發(fā)生上皮-間質轉化，獲得了某些間質細胞表型，從而造成了氣道重塑［16-17］。本次研究發(fā)現(xiàn)，CVA模型組中3種細胞連接蛋白表達均明顯下調(diào)，而中藥組和孟魯司特鈉組均有明顯的提高連接蛋白表達的作用，說明加味芎蝎散可能通過上調(diào)連接蛋白，維持細胞完整和上皮的屏障功能，抑制上皮細胞分泌Th2型細胞因子，達到緩解炎癥的作用。

芎蝎散出自宋代陳文中《小兒病源方論》，原方組成為川芎、蓽茇各1兩，蝎稍去毒尖1錢，細辛、半夏各2錢。萬全在《幼科發(fā)揮》中用芎蝎散治療“氣喘息急，嘔吐痰涎”者。CVA歷來是中醫(yī)治療的特色項目和優(yōu)勢病種。本文作者徐榮謙主任醫(yī)師在本病的發(fā)病機理中十分注重風邪，同時，他又認為，在CVA的發(fā)展過程中瘀阻肺絡也有重要的致病作用。故以芎蝎散為基礎，加白前、五味子、蘆根，組成加味芎蝎散。前期研究證實加味芎蝎散具有抗炎、抑制血管新生和細胞遷移作用。

本次研究結果顯示，加味芎蝎散能夠有效減輕CVA模型大鼠肺組織氣道炎癥程度，降低氣道黏膜上皮變性及損傷，在進一步的免疫組化和Western blotting實驗中均證明，中藥干預后，上皮連接相關蛋白的表達較模型組均有大幅提高。我們假設：加味芎蝎散能夠提高上皮連接相關蛋白的表達，穩(wěn)定了細胞間連接，從而改善了氣道的上皮屏障功能，繼而也削弱了哮喘的免疫炎癥反應。該發(fā)現(xiàn)將為我們明確CVA黏膜上皮結構功能改變以及加味芎蝎散治療CVA的作用機制提供研究基礎。