活體成像技術(shù)在NK/T細(xì)胞淋巴瘤早期檢測中的應(yīng)用價(jià)值研究

劉凡，趙玉，潘新宇，付瑤，于建渤*

淋巴瘤是一組來源于血液淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤，是世界范圍內(nèi)十大惡性腫瘤之一，好發(fā)于亞洲、墨西哥及南美洲，男女發(fā)病比率為（3～4）∶1［1-4]。隨著社會發(fā)展和腫瘤流行病學(xué)因素的變化，淋巴瘤發(fā)病年齡已呈現(xiàn)明顯年輕化趨勢，發(fā)病率逐年上升，5年生存率不足50%，成為威脅人類生命的一大殺手［5-6]。因此，探索NK/T細(xì)胞淋巴瘤早期診斷的新方法，是進(jìn)一步提高NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者生存率的關(guān)鍵［7-9]。

活體腫瘤動態(tài)監(jiān)測是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要內(nèi)容，自1999年美國哈佛大學(xué)WEISSLEDER首次提出分子影像學(xué)概念至今，分子影像學(xué)在世界范圍內(nèi)取得了長足發(fā)展，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)早期診斷疾病提供了有效技術(shù)支持［10-11]。光學(xué)分子影像學(xué)技術(shù)能夠非侵入性、實(shí)時(shí)監(jiān)測、定量分析腫瘤模型中腫塊的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移，是發(fā)展精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診療的必然方向［12]。

本研究以NK92-Luc裸鼠移植瘤模型為研究對象，以小動物活體成像儀為輔助手段，監(jiān)測NK/T細(xì)胞淋巴瘤動態(tài)生長過程，深化活體成像技術(shù)（IVIT）在NK/T細(xì)胞淋巴瘤早期研究中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 研究材料 NK92-Luc淋巴瘤細(xì)胞株由黑龍江省腫瘤重點(diǎn)防治實(shí)驗(yàn)室提供；SPF級雌性BALB/C-nu裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司；重組人白介素2（RH IL-2）購自美國R&D公司；嘌呤霉素培養(yǎng)基購自成都思天德生物科技有限公司；螢火蟲熒光素酶鉀鹽D-Luciferin購自美國Xenogen公司；小動物活體成像儀為Berthold Technology-NightOwl LB983；倒置熒光顯微鏡為尼康TS100-F。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和動物飼養(yǎng) 2015年10月—2016年10月，NK92-Luc細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素、89%的RPMI1640培養(yǎng)基、1.5 μg/ml嘌呤霉素培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SPF級雌性BALB/C-nu裸鼠，體質(zhì)量8～15 g，4～6周齡，飼養(yǎng)在SPF級超凈層流室，恒溫（24～26 ℃）飼養(yǎng)，墊料、籠具、飼料及飲水均經(jīng)過高壓滅菌和紫外線照射處理。

1.2.2 構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型 取對數(shù)生長期NK92-Luc細(xì)胞， 移 入15 ml離心 管離 心（1000 r/min，5 min，r=7 cm），棄上清液，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，適量PBS重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按照1×106個細(xì)胞/只接種密度，配置細(xì)胞懸液。將裸鼠固定在超凈工作臺中，75%乙醇溶液消毒裸鼠左側(cè)季肋皮膚，按照每只100 μl NK92-Luc細(xì)胞懸液（含1×106個細(xì)胞）的劑量，在3只裸鼠左側(cè)季肋皮下接種。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，隔天觀察裸鼠狀態(tài)。

1.2.3 常規(guī)方法觀察腫瘤生長動態(tài) 接種NK92-Luc細(xì)胞后，每天觸摸和目測接種部位，待腫塊可觸及時(shí)記為腫瘤出現(xiàn)時(shí)間。本研究中，接種腫瘤細(xì)胞第5天裸鼠均出現(xiàn)局部皮膚凸起、增厚，接種腫瘤細(xì)胞第5、8、11天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑和垂直方向最大橫徑，計(jì)算瘤體積（體積=橫徑2×長徑/2），繪制腫瘤生長曲線。

1.2.4 小動物活體光學(xué)成像技術(shù)監(jiān)測裸鼠腫瘤的生長動態(tài) 接種腫瘤細(xì)胞第5、8、11天，通過小動物活體光學(xué)成像儀檢測裸鼠皮下移植瘤的生物發(fā)光情況，取3只荷瘤裸鼠（造模和成像監(jiān)測均為相同的3只裸鼠），腹腔注射50 μl D-Luciferin（1 mg/ml），記錄注射熒光素酶底物時(shí)間；在注射D-Luciferin第7 分鐘時(shí)將裸鼠放入麻醉箱中進(jìn)行異氟烷吸入性麻醉；在注射D-Luciferin第9 分鐘時(shí)將3只裸鼠整齊放入活體成像儀暗箱平臺，調(diào)整控制平臺升降至合適視野，開啟激發(fā)光源，采用儀器配備的indigo軟件對圖像和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理；在注射D-Luciferin第14分鐘時(shí)獲取成像圖片。計(jì)算各區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，檢測發(fā)光細(xì)胞在活體動物內(nèi)的靈敏度（參數(shù)：曝光時(shí)間5 min/次）。

1.2.5 腫瘤肉眼大體觀察和蘇木素-伊紅（HE）組織形態(tài)學(xué)觀察 在實(shí)驗(yàn)完畢后，采用斷頸法處死裸鼠，剔除腫塊，行肉眼觀察，并快速用微量天平稱重。腫瘤組織切小塊，置于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋切片，HE染色，電鏡下觀察。具體步驟如下：60 ℃烤片40 min；二甲苯脫蠟2次，5 min/次；酒精梯度脫水（依次為100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、85%、75%，各3 min），自來水沖洗；浸入蘇木素液染色5 min，自來水沖洗；1%鹽酸酒精分化30 s；自來水沖洗，靜置顯藍(lán)10 min；HE染色3 min，自來水沖洗；酒精梯度脫水（依次為75%、85%、95%、100%Ⅱ、100%Ⅰ，各3 min）；二甲苯透明2次，5 min/次；中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK92-Luc細(xì)胞培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察 在顯微鏡下，NK92-Luc細(xì)胞在培養(yǎng)基中懸浮生長，成簇生長，細(xì)胞呈圓形、類圓形（見圖1）。

圖1 普通顯微鏡下NK92-Luc淋巴瘤細(xì)胞形態(tài)Figure 1 Observation of NK92-Luc cell lymphoma morphology under ordinary microscope

圖2 裸鼠移植瘤模型腫瘤生長曲線Figure 2 Tumor growth curve of the nude mouse model of subcutaneous xenograft tumor

2.2 常規(guī)方法觀察腫瘤的生長動態(tài) 在接種瘤細(xì)胞第5、8、11天腫瘤體積分別為（0.0038±0.0023）、（0.1323±0.0607）、（0.4232±0.0696）mm3； 根據(jù)3只裸鼠平均腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線，腫瘤體積在前2 d增長不明顯，在第3～5天增長明顯加快，在第6～8天增長速度最快，在第9～11天增長趨向緩和（見圖2）。

2.3 IVIT成像 在接種腫瘤細(xì)胞第5天，生物發(fā)光成像已經(jīng)可以檢測到裸鼠皮下腫瘤細(xì)胞生物發(fā)光信號。隨著接種時(shí)間延長，皮下移植瘤體積及其生物發(fā)光信號逐漸增強(qiáng)，肉眼可見每只裸鼠左側(cè)季肋部接種腫瘤細(xì)胞部位發(fā)出明亮熒光，隨著時(shí)間變化腫瘤逐漸增大（見圖3）。第5、8、11天腫瘤平均實(shí)測光子數(shù)為（53688222±25446363）、（2072443366±1029688415）、（5559915605±708457376） ph/s；根據(jù)小動物活體成像儀成像時(shí)生物發(fā)光光子數(shù)繪制曲線，其與腫瘤生長曲線的變化趨勢一致（見圖4）。

2.4 剝除腫瘤肉眼大體觀察 裸鼠在接種瘤細(xì)胞后第4～5天均能成瘤。腫瘤重量為（0.5020±0.0894） g；肉眼觀，在裸鼠局部皮下可見移植瘤為圓形或類圓形腫塊，剝除腫瘤可見腫瘤外周有纖維組織包繞，切面呈灰紅、灰白色，魚肉狀，質(zhì)嫩較脆，易出血（見圖5）。

2.5 HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察 HE染色光鏡下見腫瘤周圍由纖維組織包繞，腫瘤細(xì)胞排列成片狀或巢狀，可見腫瘤細(xì)胞浸潤血管現(xiàn)象，有不同程度的凝固性壞死；伴不同程度的炎性細(xì)胞浸潤，如淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞等；瘤細(xì)胞大小不一，核型不規(guī)則，胞漿中等量，可見病理性核分裂象（見圖6A）；肝臟失去正常組織形態(tài)，伴隨腫瘤細(xì)胞浸潤（見圖6B）。

3 討論

圖3 裸鼠移植瘤模型IVIT成像Figure 3 IVIT imaging of nude mouse model of subcutaneous xenograft tumor

圖4 接種腫瘤細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)生物發(fā)光光子數(shù)曲線Figure 4 Curve of number of bioluminescent photons at different time points after inoculation of tumor cells

圖5 肉眼觀察3只裸鼠腫瘤形態(tài)變化Figure 5 Naked-eye observation of tumor morphological changes in three nude mice

圖6 裸鼠腫瘤組織和肝臟病理組織學(xué)表現(xiàn)（HE染色，×200）Figure 6 Tumor and liver histopathological findings of the nude mouse

近年來，IVIT在腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及基因治療等領(lǐng)域備受研究者關(guān)注。與傳統(tǒng)腫瘤診療技術(shù)相比，IVIT具有傳統(tǒng)技術(shù)不可比擬的優(yōu)勢，能夠無創(chuàng)、連續(xù)、動態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長變化，為研究腫瘤相關(guān)的動物實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)［13-14]。目前，建立人類裸鼠腫瘤移植瘤模型是現(xiàn)今生物醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究的重要工具，通過模擬人體環(huán)境，借助活體生物發(fā)光成像系統(tǒng)可直觀、連續(xù)、敏感地對腫瘤進(jìn)行動態(tài)可視化觀察，指導(dǎo)醫(yī)生制定最適診療方案［15-16]。鑒于腫瘤細(xì)胞本身無光學(xué)特性，因此，通過能發(fā)光且可檢測的生物源性熒光——Luc基因標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞攜帶可發(fā)光的Luc基因，隨后將該類具備發(fā)光性能的細(xì)胞接種于裸鼠皮下，在裸鼠腹腔注射熒光素酶底物后，即可通過小動物活體成像儀中靈敏的CCD相機(jī)設(shè)備定量檢測體內(nèi)所發(fā)射的光子數(shù)量并最終轉(zhuǎn)換為人類肉眼可見圖像，達(dá)到連續(xù)動態(tài)觀測腫瘤生長變化的目的。

本研究首先常規(guī)培養(yǎng)NK92-Luc細(xì)胞，在顯微鏡下，可見NK92-Luc細(xì)胞在培養(yǎng)基中呈懸浮、成簇狀生長，細(xì)胞形態(tài)為圓形、類圓形，生長情況較好。隨后，成功建立裸鼠皮下NK/T細(xì)胞淋巴瘤移植瘤模型。這與任苑蓉等［17]用于研究人大細(xì)胞肺癌而構(gòu)建的L9981-Luc研究結(jié)果相一致。同時(shí)，測量第5天、8天、11天荷瘤裸鼠腫瘤體積，結(jié)果表明3只裸鼠腫瘤體積在前2 d增長不明顯，在第3～5天腫瘤體積增長明顯加快，在第6～8天腫瘤體積增長速度最快，這表明腫瘤細(xì)胞進(jìn)入裸鼠皮下后可迅速擴(kuò)增。在腫瘤細(xì)胞注射至裸鼠皮下第5天，通過小動物活體成像儀觀測到腫瘤部位較強(qiáng)的熒光信號，熒光信號越強(qiáng)反映腫瘤細(xì)胞數(shù)量越多，也代表腫瘤體積越大，結(jié)果顯示，腫瘤部位熒光信號強(qiáng)度隨天數(shù)增加而增強(qiáng)。根據(jù)小動物活體成像儀成像時(shí)生物發(fā)光光子數(shù)繪制的曲線，與腫瘤生長曲線變化趨勢一致，證明本研究使用無創(chuàng)技術(shù)，達(dá)到了連續(xù)示蹤裸鼠體內(nèi)腫瘤變化的目的。這說明小動物活體成像儀可成功監(jiān)測裸鼠皮下移植瘤模型的演進(jìn)過程，可為腫瘤體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移等研究提供無創(chuàng)、定量示蹤手段［18-19]。

綜上，本研究以NK92-Luc細(xì)胞、裸鼠皮下移植瘤模型為研究對象，成功構(gòu)建NK/T細(xì)胞淋巴瘤，通過IVIT動態(tài)觀測并示蹤活體腫瘤，初步探索NK/T細(xì)胞淋巴瘤的診斷新方法，具有重要的科學(xué)價(jià)值和臨床意義。