工頻電磁場對小鼠海馬神經元細胞系HT22增殖、凋亡及磷酸化JNK、ERK表達的影響

龍哲，王旭，侯偉建，楊丹，5

（1. 東北大學中荷生物醫學信息與工程學院，沈陽 110819； 2. 中國醫科大學公共基礎學院生物醫學工程教研室，沈陽 110122；3. 東北大學信息科學與工程學院，沈陽 110819；4. 中國醫科大學公共基礎學院組織工程學教研室，沈陽 110122；5. 東北大學智能工業數據解析與優化教育部重點實驗室，沈陽 110819）

隨著科技的發展，生活環境中電磁場分布日益 復雜，電磁場對生命健康的影響越來越受到關注。近年來流行病學研究［1-3］發現，電磁場曝露可能誘發多種疾病，并且與電磁場類型、曝露的強度和時間均有關系。極低頻電磁場可誘導小鼠腦和肝細胞凋亡［4］。低頻交變電磁場影響大鼠骨髓間充質干細胞增殖及分化［5］。低頻脈沖電磁場通過激活絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信號通路促進成肌細胞增殖作用［6］。

MAPK家族是將信號從細胞表面轉導至細胞核的重要傳遞者，c-Jun氨基末端激酶 （c-Jun N-terminal kinase，JNK） 和細胞外信號調節激酶 （extracellular signal regulated kinase，ERK） 是MAPK家族的主要成員。當機體受外界刺激，細胞內JNK和ERK蛋白磷酸化水平發生改變，參與增殖、分化、代謝和氧化應激等細胞活動［7-9］。50 Hz極低頻電磁場曝露的人黑素細胞，能夠抑制JNK和ERK磷酸化水平，促進黑色素的產生［10］。人表皮細胞HaCaT經中波紫外線照射后，JNK和ERK磷酸化水平上升，MAPK信號通路產生活化效應［11］。

本研究通過對HT22細胞進行3種強度工頻電磁場短時曝露，觀察不同強度電磁場曝露對細胞的增殖、凋亡及JNK和ERK磷酸化水平的影響，進而為工頻電磁場安全閾值的確立提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠海馬神經元細胞系HT22購自北京北納創聯生物技術研究院。DMEM-H培養基購自美國HyClone公司；胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibico公司；細胞增殖檢測試劑盒購自美國Biovision公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊公司；p-JNK抗體、p-ERK抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗IgG （H+L） 購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：小鼠海馬神經元細胞系HT22采用含10%胎牛血清的DMEM-H培養基，在37℃、5% CO2條件下培養。采用對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 工頻電磁場刺激：利用工頻電磁場發生器 （東北大學電子科學與信息光學研究所自行研制） ，將HT22細胞隨機分成4組，其中1組為對照組，不作任何處理，其余3組為實驗組，分別曝露于強度為10、20、30 mT的工頻電磁場中，20 min/d，連續3 d。

1.2.3 細胞增殖檢測：將經曝露的各組HT22細胞分別接種于96孔板中，密度為5×103/孔，37℃、5% CO2孵育24、48、72 h后，每孔加入MTS試劑20 μL，孵育2 h，利用全自動酶標儀測量490 nm處各孔的OD值。

1.2.4 細胞凋亡檢測：收集經曝露的各組HT22細胞，PBS漂洗后，計數5×105個，離心，加入500 μL Binding buffer重 懸 細 胞 后，加 入5 μL Annexin V-FITC，混勻，再加入10 μL PI染液，再次混勻，室溫避光染色10 min，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 Western blotting檢測：收集經曝露的各組HT22細胞，加入適量RIPA裂解液離心提取總蛋白，用Bradford法檢測蛋白濃度。各組取30 μg蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBST漂洗3 次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗IgG （H+L） 孵育2 h，TBST漂洗3 次，每次5 min，利用ECL成像系統進行顯影。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同強度電磁場曝露后對HT22細胞形態的影響

大部分HT22細胞形態舒展，貼壁分布均勻。經電磁場曝露后細胞生長迅速，細胞增多，細胞排列密集。見圖1。

圖1 HT22細胞經不同強度電磁場曝露后3 d的形態變化 ×200Fig.1 Morphology of HT22 cells with and without exposure to magnetic fields for three days ×200

2.2 不同強度電磁場曝露后對HT22細胞增殖的影響

MTS結果顯示，HT22細胞經不同強度電磁場曝露后，均明顯促進細胞增殖。電磁場曝露后24 h，細胞生長活力最強，之后隨時間延長，增殖活力降低，但仍顯著高于對照組。20 mT組促進生長增殖效果最顯著，差異有統計學意義 （P ＜ 0.01） 。電磁場強度和細胞生長增殖率呈非線性依賴關系。見表1。

表1 各組HT22細胞增殖率 （%） Tab.1 Cell proliferation in each group （%）

2.3 不同強度電磁場曝露后對HT22細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染后，流式細胞儀檢測不同強度工頻電磁場曝露后HT22細胞凋亡的變化。與對照組相比，10 mT組凋亡率為2.32%±0.04%，20 mT組凋亡率為2.55%±0.06%，30 mT組凋亡率為2.17%±0.03%。隨著曝露電磁場強度增加，各實驗組細胞凋亡率未見明顯變化。工頻電磁場10 mT、20 mT和30 mT均未誘導HT22細胞凋亡。

2.4 不同強度電磁場曝露后對HT22細胞p-JNK與p-ERK表達的影響

Western blotting結果顯示，不同強度電磁場曝露后HT22細胞p-JNK與p-ERK表達均明顯升高。見圖2。

圖2 Western blotting檢測p-JNK和p-ERK表達水平Fig.2 Western blotting analysis of p-JNK and p-ERK expression

3 討論

近年來，電磁場的安全性受到研究人員的廣泛關注，國際腫瘤研究中心機構將工頻電磁場分類為“懷疑對人體致癌的”。但是，國際非電離輻射防護委員會發表的《限制時變電場和磁場曝露的導則》中認為工頻電磁場與生物體之間的作用機制尚不明確，對癌癥發生缺乏已確定的因果關系。電磁場作為一種外加的物理因子，作用于細胞的機制非常復雜，已有的研究表明，磁場類型、曝露方式、曝露時間的不同對細胞的增殖、凋亡、信號通路等影響各不相同［12-13］。研究［14］表明，5 mT強度脈沖電磁場可以增強人臍靜脈內皮細胞的增殖能力，促進血管內皮細胞增殖。但是也有研究［15］表明，1.10～4.10 mT強度的固定頻率脈沖電磁場對小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1的增殖能力無明顯影響。本研究利用工頻電磁場0、10、20、30 mT曝露HT22細胞，觀察到10、20、30 mT明顯促進HT22細胞的增殖，這與湯翔宇等［16］報道的結果 （BMSC細胞） 類似。在3種強度作用下，20 mT強度電磁場曝露對HT22細胞增殖促進作用最強。

JNK和ERK作為MAPK的主要成員，可被電離輻射、生長因子、滲透壓、細胞因子等多種外界刺激激活，并在細胞增殖、凋亡和分化等過程中起到關鍵作用［17］。王蕾等［18］采用化學動力學方程構建與電磁場敏感ERK相關的MAPK信號模型，得出電磁場可以激活ERK通路。本研究結果表明，工頻電磁場10、20、30 mT曝露HT22細胞可以使其JNK、ERK磷酸化水平增高，這與孫文鈞等［19］研究中0.4 mT和0.8 mT工頻電磁場可以激活JNK、使其磷酸化報道結果類似。

MAPK是一種存在于大多數細胞中的胞內絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPK信號途徑使真核細胞能夠將細胞外信號轉導至細胞內，引起細胞反應，并通過影響基因的轉錄和調控，影響細胞的生物學行為 （如增殖、分化、轉化、凋亡等） 。JNK受到外界刺激后被活化轉到細胞核內，使其下游底物氨基末端激酶蛋白等磷酸化，參與多種外界刺激的應激反應，與細胞增殖凋亡密切相關；ERK廣泛存在于各種組織中，活化后可將信號轉導入細胞核，其活性增高與持續時間的長短決定對刺激的反應形式，對細胞增殖、生長和分化等方面有重要的調節作用［20］。補骨脂素可以通過劑量依賴方式刺激成骨細胞增殖，并且增加p-JNK和p-ERK的表達，特異性的抑制JNK和ERK的磷酸化可以有效地抑制補骨脂素對成骨細胞的增殖作用［21］。醋酸艾塞那肽可以通過激活JNK和ERK的磷酸化，促進大鼠脂肪來源干細胞的增殖［22］。

綜上所述，本研究認為10 mT、20 mT和30 mT這3種強度工頻電磁場曝露可能通過調控ERK和JNK的活化促進HT22細胞增殖。但是由于生物多樣性和電磁場復雜度的原因，工頻電磁場曝露通過調控ERK和JNK的活化促進細胞增殖還需要更多的實驗結果證明。