麻瘋樹籽酶解液納米乳液體系構建及其穩定性研究

王 勇 許 晶 連子騰 郭明輝

(1.東北林業大學生物質材料科學與技術教育部重點實驗室， 哈爾濱 150040；2.東北農業大學學生工作處， 哈爾濱 150030； 3.東北農業大學文理學院， 哈爾濱 150030；4.東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

麻瘋樹(JatrophacurcasL.)屬于大戟科麻瘋樹屬的灌木或者小喬木，在我國主要種植或半野生于熱帶、亞熱帶地區，分布廣泛，資源豐富。麻瘋樹籽大，結實多，含有豐富的油脂，約占其質量的50%左右，是制備生物柴油的一種理想原料[1-4]。同時麻瘋樹籽含有萜類、酚類、黃酮類等多種活性成分，具有殺螺、殺蟲、抗菌等功效[5]。目前，常見的油料提油方法主要分為機械壓榨法和溶劑浸提法，這兩種方法均不能有效分離細胞壁和包裹在細胞壁中的蛋白質，容易使油脂殘留在餅粕中，導致殘油率較高[6-7]。隨著近年來生物技術的快速發展，酶劑制備工藝簡化、價格大幅降低。由于水酶法提油技術具有作用條件溫和、環境友好等特性，同時能夠降低高溫對油脂中活性生物質的破壞，已被認為是一項極具前途的植物油提取技術[8]。

水酶法處理麻瘋樹籽后，可得到游離麻瘋樹籽油、酶解液及殘渣。酶解液中含有佛波醇酯、植物凝集素、胰蛋白酶抑制劑等抗營養因子和毒素。佛波醇酯是麻瘋樹中的一類二萜酯，常溶解于麻瘋樹籽油中，被認為是麻瘋樹籽中的主要毒性物質之一，不僅能導致溫血動物中毒，而且對無脊椎動物的蝦、蟹和多種軟體動物也具有殺滅作用[9-10]。許多學者對麻瘋樹籽油中佛波醇酯的殺蟲活性以及對人體細胞毒性機制進行了研究[11-13]。佛波醇酯可作為植物源生物農藥的有效成分，但其化合物不穩定，對熱、光、氧氣、酸和堿較敏感，容易發生氧化、酯化和差向異構化，因此，使用過程中需要在無氧環境、避光等條件下貯存[14]。

納米乳液以納米材料吸附或包裹活性物質，其具有納米級粒徑和較大比表面積，可以有效提高活性物質的分散性和穩定性，具有在儲藏、運輸過程中無絮凝、無聚集的優點，可作為有效酯類物質載體[15-19]。目前，納米乳液制備技術已經逐漸成熟，納米乳液具有抗沉降和乳析的動力學穩定特性，吸收迅速完全，能增強保健效果，降低毒副作用，具有很大的發展潛力，在特定條件下能長期保持動力學穩定性，在儲存過程中無絮凝、聚集、沉淀、奧斯特瓦爾德成熟現象，被看成是一種近熱力學穩定體系。高壓均質機在食品領域中常用于制備納米乳劑、納米粒、脂質體等，制備工藝一般為先進行粗乳制備，再經高壓均質得到較小粒徑和均勻一致的制劑。高壓均質機的可控設備參數有均質壓力、循環次數、循環時間和溫度等，制劑粒子大小和分布一般隨著均質壓力增大和循環次數增多明顯下降，到達一定壓力和循環次數后漸趨平衡；也有的制劑當壓力和循環次數超過一定值后，平均粒徑和分布反而增大；在制備納米乳液時需選擇合適的均質壓力、均值次數等。

鑒于此，本文對高壓均質納米乳液的制備工藝進行優化，以獲得高穩定性、高功能性納米乳液。應用麻瘋樹籽水酶法產物中的乳狀液及水解液為復合乳化劑，通過高壓均質技術制備麻瘋樹籽酶解液納米乳液，評價其平均粒徑及分散性、ζ-電位變化、濁度以及穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻瘋樹(JatrophacurcasL.)籽，云南神宇新能源有限公司；酸性蛋白酶(200 000 U/g)，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW-200型萬能粉碎機，北京中興偉業儀器有限公司；索氏提取儀，瑞士步琪公司；HH-S型數顯恒溫水浴鍋，濟南海能儀器股份有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱，寧波江南儀器廠；101-1A型數顯恒溫干燥箱，上海東美建材試驗設備有限公司；RE-52B型旋轉蒸發器，上海隆拓儀器設備有限公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；分樣篩(40目)，Zetasizer Nano-ZS 90型光散射粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；紫外-可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；Turbiscan Lab Expert 型濃縮體系穩定性分析儀，法國Formulaction公司；BX53型OLYMPUS顯微鏡，日本奧林巴斯公司；激光共聚焦顯微鏡，匯佳生物股份(中國)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1麻瘋樹籽酶解液

將麻瘋樹籽剝殼除雜后，先經粉碎機粉碎，過40目分樣篩，得到麻瘋樹籽仁粉。稱取10 g麻瘋樹籽仁粉，常壓蒸汽熱處理5 min滅酶，冷卻后，調節液料比為6.31 mL/g、加酶量為3.5%、酶解溫度為56℃、酶解時間為2.13 h，酶解結束后升溫至90℃、10 min滅酶。滅酶處理后經高速離心分離，獲得游離麻瘋樹籽油、乳狀液、水解液及殘渣。

1.3.2麻瘋樹籽酶解液納米乳液

在1.3.1節制備得到的酶解液(乳狀液和水解液)中，加入一定比例的水，采用磁力攪拌器充分攪拌后，用高速分散器在25℃、20 000 r/min下分散5 min，在高壓均質機內進行納米乳液制備。

1.3.3制備工藝優化

以納米乳液的平均粒徑、分散性指數(Polydispersity index, PDI)及乳化產率為考察指標，通過單因素試驗考察乳狀液添加量、水解液添加量、高壓均質壓力、均質次數對3個指標的影響。進一步利用Design-Expert軟件進行響應面分析設計優化試驗，選取乳狀液添加量、水解液添加量、高壓均質壓力3個因素為自變量，以平均粒徑R1、乳液穩定性指數(Turbiscan stability index, TSI)R2及乳化產率R3為響應值，設置三因素三水平進行試驗。

1.3.4納米乳液粒徑分布、PDI及ζ-電位

用光散射粒度分析儀分別測定納米乳液的粒徑分布規律及ζ-電位變化，油滴折射率設置為1.45，水相溶液折射率設置為1.33。為了降低多重光散射效應，分析前用pH值 7.5的磷酸鹽緩沖液稀釋納米乳液1 000倍測定平均粒徑及PDI，稀釋50倍測定ζ-電位。

1.3.5納米乳液濁度

將納米乳液用pH值 7.5的磷酸鹽緩沖液溶液稀釋40倍，以pH值 7.5的磷酸鹽緩沖液為空白對照，用紫外-可見分光光度計測定600 nm處的吸光度，濁度計算公式為

(1)

式中A——稀釋納米乳液在600 nm處的吸光度

V——稀釋倍數

I——光程差，取0.01 m

1.3.6納米乳液乳化產率

以乙醇/正己烷(體積比1∶1)混合有機相分別萃取乳狀液、水解液、納米乳液中的麻瘋樹籽油，納米乳液的乳化產率Q計算公式為

(2)

式中W1——納米乳液中麻瘋樹籽油質量

W2——乳狀液、水解液、納米乳麻瘋樹籽油的總質量

1.3.7納米乳液穩定性

利用濃縮體系穩定性分析儀對納米乳液的穩定性進行分析。試驗中，取18 mL麻瘋樹籽酶解液納米乳液于Turbiscan穩定性分析儀專用的圓柱形玻璃杯中。在55℃條件下每30 min掃描一次，掃描6 h。由此獲得反映納米乳液穩定性的差值反射光量(ΔBS)隨時間的動態變化，即可作出衡量納米乳液穩定性的圖譜，記錄TSI。

1.3.8納米乳液界面蛋白吸附量

界面蛋白含量測定參照文獻[20]的方法。將新制備的納米乳液經12 000 r/min離心60 min，離心溫度為20℃。離心結束后，將離心管頂部的乳清層小心轉移到濾紙上，濾去多余水分，然后用水復溶到初始體積。用注射器轉移離心管下層的清液，并用0.22 μm的濾膜過濾。采用凱氏定氮法測定下清液中的蛋白含量。界面蛋白吸附量計算公式為

(3)

式中Γ——界面蛋白吸附量，mg/m2

Ctotal——最初乳狀液中總的蛋白質量比，g/g

Cserum——乳清層中的蛋白質量比，g/g

S——液滴的比表面積，m2/g

1.3.9納米乳液顯微觀察

使用載玻片及蓋玻片處理納米乳液，通過光學顯微鏡觀察納米乳液的顯微結構。

1.3.10納米乳液激光共聚焦顯微觀察

分別將0.001 g/mL尼羅紅和0.001 g/mL尼羅藍溶解在丙醇中，漩渦混合30 s后對堿納米乳液染色30 min。染色結束后取10 μL乳液于載玻片上，采用激光共聚焦顯微鏡觀測納米乳液的顯微結構。

1.3.11數據統計及分析

所有試驗均進行3次平行測定，利用SPSS Statistics 22軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。采用Origin 9.1軟件進行數據分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1乳狀液添加量

控制水解液添加量40%、高壓均質壓力120 MPa、均質次數3次，調節乳狀液添加量分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%，考察乳狀液添加量對納米乳液平均粒徑、ζ-電位、PDI、乳化產率、濁度及TSI的影響。

由表1可知，隨著乳狀液添加量的增加，納米乳液平均粒徑及PDI呈先降低后增高的變化趨勢。這是由于隨著乳狀液添加量的提高，麻風樹籽蛋白更多地覆蓋于油水界面處，降低了界面張力。當乳狀液添加量為15%時，麻風樹籽蛋白在液滴表面形成緊密的界面膜，納米乳液液滴粒徑相對較小且其分布較為集中，此時納米乳液處于均一、穩定的狀態。而過多添加乳狀液會形成局部的麻風樹籽蛋白聚集，影響麻風樹籽蛋白在界面處的舒張展開，增大納米乳液的粒徑。此情況在濁度隨乳狀液添加量增加而增大上可以得到印證。ζ-電位絕對值隨著乳狀液添加量的增加呈現逐漸增大后降低的變化趨勢，而納米乳液TSI呈現先降低后增加的變化趨勢。結果表明，適量增大乳狀液添加量可穩定納米乳液，但過量添加乳狀液則易造成納米乳液失穩。納米乳液的乳化產率呈現先增加后降低的變化趨勢，這與其平均粒徑及穩定性的變化趨勢有關。綜合上述結果可知，應選擇乳狀液添加量為15%進行后續工藝優化研究。

表1 乳狀液添加量對納米乳液穩定性的影響Tab.1 Effect of additive amount of emulsion on stability of nanoemulsion

注：同一列數據后的不同字母代表樣品間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.2水解液添加量

控制乳狀液添加量20%、均質壓力120 MPa、均質次數3次，調節水解液添加量分別為30%、35%、40%、45%、50%，考察水解液添加量對納米乳液平均粒徑、ζ-電位、PDI等的影響，如表2所示。

表2 水解液添加量對納米乳液穩定性的影響Tab.2 Effect of additive amount of hydrolysate on stability of nanoemulsion

由表2可知，隨著水解液添加量的增大，納米乳液的平均粒徑呈現先降低后增加的變化趨勢，PDI呈現先降低后增大再降低的變化趨勢。這可能是由于水解液中的多肽補充了納米乳液表面蛋白的乳化層間隙，進而提高了納米乳液的乳液穩定性，但過高的水解液添加量會稀釋納米乳液，不利于納米乳液的形成。納米乳液絮凝主要受界面層上發生的吸引和排斥作用影響，增強液滴間的靜電可提高納米乳液抗絮凝能力，液滴ζ-電位越大納米乳液穩定性越好[21]。隨著水解液添加量的增加，更多帶負電荷的水解多肽吸附于納米乳液界面處，提高了納米乳液的ζ-電位電勢，提高了納米乳液的穩定性，進一步表現于TSI的降低上。雖然50%水解液添加量時乳液的ζ-電位絕對值最大，但卻造成了乳滴絮凝程度的增加，故而造成了TSI的增加。由于水解液添加量為45%時，納米乳液具有最佳的穩定性及乳化特性，采用此值進行后續響應面優化設計試驗。

2.1.3高壓均質壓力

控制乳狀液添加量20%、水解液添加量40%、均質次數3次，調節均質壓力分別為30、60、90、120、150 MPa，考察高壓均質壓力對納米乳液平均粒徑、ζ-電位、PDI、乳化產率、濁度及TSI的影響。

表3結果表明，隨著均質壓力增大，納米乳液平均粒徑呈現先降低后增大的變化趨勢。這是由于在高壓均質納米乳液制備過程中，乳液分散相顆粒在巨大剪切、撞擊、空穴效應的作用下，逐漸形成納米粒徑乳滴。隨著均質壓力的不斷增加，機械作用力輸出強度增大，顆粒粒徑減小、分布更為均一。而當均質壓力高于90 MPa時，由于均質壓力過高機械輸出作用過強，分散相粒徑的比表面積急劇增加, 有限的乳化劑不能被有效吸附到所有液滴表面上, 乳化作用下降，液滴相互聚集，出現不穩定現象，粒徑反而變大，擴大了納米乳液的粒徑分布范圍[22]。納米乳液乳化產率也呈先增大后降低的變化規律，在高均質壓力下納米乳液乳化產率增加與乳滴聚集有關。當均質壓力達到90 MPa后，納米乳液平均粒徑增加與乳化產率降低均可能與過高均質壓力造成的納米乳液乳滴裂解營養素流失有關。但過高均質壓力(150 MPa)輸出下，乳化界面伴隨著乳滴裂解發生了失穩現象，此時納米乳液的ζ-電位絕對值顯著降低。均質壓力低于90 MPa時，納米乳液濁度隨均質壓力增大呈現逐漸降低的變化趨勢，表明納米乳液隨壓力增大呈現更均一的乳滴分布。而均質壓力高于90 MPa時，納米乳液濁度的增大進一步證實了乳滴裂解現象的發生。綜合納米乳液特性及穩定性考慮，本研究擬選擇均質壓力為90 MPa進行后續研究。

表3 均質壓力對納米乳液穩定性的影響Tab.3 Effect of homogenization pressure on stability of nanoemulsion

2.1.4高壓均質次數

控制乳狀液添加量20%、水解液添加量40%、均質壓力120 MPa，調節均質次數分別為1、2、3、4、5次，考察高壓均質次數對納米乳液平均粒徑、ζ-電位、PDI、乳化產率、濁度及TSI的影響，如表4所示。

由表4可以看出，隨著均質次數的不斷增加，納米乳液的平均粒徑整體呈不斷減小的變化規律，ζ-電位絕對值呈現逐漸增大的變化規律。FLOURY等[23]研究指出，在一定均質壓力下，隨著均質次數的增加，粒徑有不斷下降的趨勢，這可能是由于隨著均質循環次數的不斷增加，其機械作用的時間變長，之前未被均質細化的大顆粒或小顆粒聚集體在多次均質后粒徑減小，乳液乳滴更加穩定。但當納米乳液均質次數為5次時，納米乳液的平均粒徑增大及ζ-電位絕對值降低，這是由于均質過程中提供大量能量導致新液滴的快速重聚集，即過處理現象[24]。高頻的聚集現象和極高的能量密度是產生過處理現象發生的主要原因之一[25-26]。在此條件下的較大納米乳液濁度也說明了聚集行為的發生。乳液的PDI呈現先降低后增大的變化趨勢，這可能與更多小乳滴及過渡態中尺寸乳滴伴隨這均質次數增加逐漸形成有關，而均質5次時過處理現象導致的聚集行為則是納米乳液PDI增大的可能原因。大豆蛋白-磷脂酰膽堿納米乳液的乳化產率隨均質次數增多呈逐漸增大的變化趨勢，而均質次數超過4次后，納米乳液乳化產率不再繼續增大。在實際應用中，均質壓力與均質次數的合適比率對節約成本、減少機器工作時間、實現目標粒徑乳狀液的制備有重要作用，但均質壓力過高、均質次數過多，乳狀液粒徑減小趨緩，甚至重新聚集而使平均粒徑增大，分布變寬。綜合考慮，本研究擬設計均質4次進行后續納米乳液制備試驗。

2.2 響應面優化試驗

本試驗利用統計軟件Design-Expert進行響應曲面法優化，以乳狀液添加量、水解液添加量、均質壓力為自變量，納米乳液的平均粒徑、TSI 及乳化產率為響應值，根據中心組合設計原理，確定高壓均質法制備納米乳液的最佳工藝條件，響應面試驗方案及結果見表5、6，表6中A、B、C分別表示乳狀液添加量、水解液添加量、高壓均質壓力的編碼值。

表5 試驗因素編碼Tab.5 Encode of factors

通過統計分析軟件Design-Expert進行數據分析，建立平均粒徑R1二次響應面回歸模型為

R1=300.68-19.30A-11.04B-10.91C+2.77AB+
13.38AC+1.65BC+31.26A2+25.18B2+ 25.99C2

(4)

表6 試驗安排及結果Tab.6 Experiment scheme and results

表7 平均粒徑回歸與方差分析結果Tab.7 Results of regression and variance analysis of average particle size

圖1 各因素對納米乳液平均粒徑影響的響應面圖Fig.1 Response surface diagrams showing effect of factors on average particle size of nanoemulsion

圖2 各因素對納米乳液TSI影響的響應面圖Fig.2 Response surface diagrams showing effect of factors on TSI of nanoemulsion

通過統計分析軟件Design-Expert進行數據分析，建立TSI(R2)二次響應面回歸模型為

R2=3.00+0.013A+0.12B+0.087C+0.025AB-0.01AC+0.020BC+0.81A2+0.12B2+0.30C2

(5)

表8 TSI回歸與方差分析結果Tab.8 Results of regression and variance analysis of TSI

通過統計分析軟件Design-Expert進行數據分析，建立乳化產率R3二次響應面回歸模型為

R3=92.09+0.50A+0.35B+0.99C+0.28AB+
0.12AC+0.18BC-1.30A2-2.36B2-1.78C2

(6)

表9 乳化產率回歸與方差分析結果Tab.9 Results of regression and variance analysis of emulsion productive rate

圖3 各因素對納米乳液乳化產率影響的響應面圖Fig.3 Response surface diagrams showing effect of factors on emulsion productive rate of nanoemulsion

采用聯合求解法確定平均粒徑、TSI及乳化產率最優條件為：乳狀液添加量15.55%、水解液添加量45.25%、高壓均質壓力91.3 MPa，此條件下平均粒徑297.8 nm，TSI為3.03，乳化產率92.24%。為適應生產，將制備條件優化為乳狀液添加量15.55%，水解液添加量45.25%，高壓均質壓力91 MPa，此條件下納米乳液平均粒徑297.2 nm，TSI為2.98，乳化產率92.47%。說明響應值的試驗值與回歸方程預測值吻合良好。

通過光學顯微鏡對納米乳液進行觀察，結果如圖4所示。由圖可知，通過本研究制備的納米乳液粒徑均一、乳液狀態穩定。且通過界面蛋白含量分析，本研究制備的納米乳液界面蛋白吸附量高達31.20 mg/m2，高界面蛋白含量起到了穩定乳液的作用。

圖4 納米乳液顯微及激光共聚焦顯微成像圖Fig.4 Microscopic observation images of nanoemulsion

3 結束語

通過響應曲面法優化確定了以水酶法處理麻風樹籽得到的乳狀液及水解液為復合乳化劑，調配制備納米乳液的工藝，確定的最優工藝為：乳狀液添加量15.55%、水解液添加量45.25%、高壓均質壓力91 MPa、均質次數4 次，此條件下納米乳液平均粒徑297.2 nm，TSI為2.98，乳化產率為92.47%。本研究制備的納米乳液粒徑均一、乳液狀態穩定，且納米乳液界面蛋白吸附量高達31.20 mg/m2，高界面蛋白含量起到了穩定乳液的作用。