TFF1基因啟動子雙熒光素酶報告基因載體的構建及活性鑒定

李俊龍 劉小康 王祎△

(1.第三軍醫大第一附屬醫院西南醫院研究中心，重慶 404100；2.四川大學華西基礎醫學與法醫學院，四川 成都 610041)

三葉因子1(Trefoil factor 1，TFF1)是三葉因子家族蛋白之一，又稱為雌激素誘導蛋白，首先在雌激素受體表達陽性的人乳腺癌細胞MCF-7中發現，是典型的雌激素應答基因[1]。TFF1在胃腸道粘膜屏障和修復中發揮重要作用，包括細胞的遷移、分化、血管生成等[2, 3]。在胃癌細胞中，TFF1通過上調細胞周期依賴性激酶的水平，延遲細胞的周期進程，抑制細胞凋亡[4, 5]。并且也有研究表明在胃癌的發生發展過程中，TFF1通過下調miR504的水平激活p53基因的表達，從而發揮抗腫瘤作用[6]。總之，目前對于TFF1在不同腫瘤中發揮的作用及其作用機制存在爭議的。而另一方面，近年來有學者膽囊癌患者的原發性腫瘤組織中發現了雌激素受體ER以及孕激素受體PR的大量表達，并且通過免疫組化檢測到了TFF1的陽性表達，提示TFF1在膽囊癌的發生發展過程中具有重要作用[7]。因此本研究構建了含有人TFF1基因野生型啟動子質粒和突變型質粒的熒光素酶報告基因載體，并研究了雌激素對TFF1啟動子轉錄活性的影響，為尋找TFF1基因的核心啟動子序列，進一步研究TFF1基因的轉錄調控機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞

膽囊癌細胞GBC-SD細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫、大腸桿菌感受態細胞E.coli DH5α購自日本Takara公司；定向誘變試劑盒購自美國Stratagene公司；載體質粒pGL3-Basic質粒以及內參質粒pRL-SV40質粒和雙熒光素酶檢測試劑盒均購自美國Promega公司；轉染脂質體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；質粒提取試劑盒購自美國Omega公司。

1.2 方法

1.2.1構建人野生型及突變型TFF1基因啟動子熒光素酶報告基因載體

根據NCBI數據庫中人TFF1基因序列(登錄號：AB038162.1)，選取TFF1基因CDS區前-568位至-2位核苷酸作為啟動子序列，其中包含經典的雌激素應答元件(Estrogen response elements，ERE)序列和非經典雌激素受體結合部位——激活蛋白1(Activating protein-1，AP-1)結合位點序列。并在5′端加入KpnI酶切位點，在3′端加入Hind III酶切位點，基因合成序列如下：GGTACC(KnpI)GATTACAGGCGTGAGCCACTGCGCCAGGCCTACAATTTCATTATTAAAACAATTCCACTGTAAAAGAATTAGCTTAGGCCTAGACGGAATGGGCTTCATGAGCTCCTTCCCTTCCCCCTGCAAGGTCACGGTAGGCC(ERE)ACCCCGTGAGCCACTGTTGTCACGGCCAAGCCTTTTTCCGGCCATCTCTCACTATGAATCA(AP-1)CTTCTGCAGTGAGTACAGTATTTACCCTGGCGGGAGGGCCTCTCAGATATGAGTAGGACCTGGATTAAGGTCAGGTTGGAGGAGACTCCCATGGGAAAGAGGGACTTTCTGAATCTCAGATCCCTCAGCCAAGATGACCTCACCACATGTCGTCTCTGTCTATCAGCAAATCCTTCCATGTAGCTTGACCATGTCTAGGAAACACCTTTGATAAAAATCAGTGGAGATTATTGTCTCAGAGGATCCCCGGGCCTCCTTAGGCAAATGTTATCTAACGCTCTTTAAGCAAACAGAGCCTGCCCTATAAAATCCGGGGCTCGGGCGGCCTCTCATCCCTGACTCGGGGTCGCCTTTGGAGCAGAGAGGAGGCAAGCTT(HindⅢ)。另外使用DNASTART軟件，分別設計ERE位點突變和AP-1位點突變的TFF1基因序列，啟動子基因序列由蘇州金唯智公司合成。將目的片段克隆至pGL3-Basic載體上，于16℃連接過夜，次日將產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，接種于含Amp的LB固體培養皿，37℃倒置培養過夜。分別挑取單克隆，接種于LB液體培養基，提取質粒進行酶切鑒定，并送蘇州金唯智公司進行測序鑒定。

1.2.2啟動子熒光素酶活性鑒定

膽囊癌細胞GBC-SD細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中。將2×105個細胞接種于24孔板中，于37℃、5% CO2培養箱中培養過夜。細胞處理分為空白對照組(轉染pGL3-Basic質粒)，實驗組(轉染野生型或突變型重組質粒)。當細胞達到70-80%融合度時，參照Lipo2000轉染試劑說明，每孔中的比例為DNA：Lipo=0.5 μg：2 μL，將構建基因與相應的內參基因pRL-SV40按照9：1的比例共轉染細胞。24 h后裂解細胞，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明測定各組的相對熒光素酶活性。

1.2.3統計學處理

2 結果

2.1 TFF1啟動子熒光素酶報告基因載體雙酶切鑒定結果

提取構建好的pGL3-TFF1質粒，pGL3-TFF1-△ERE突變質粒，pGL3-TFF1-△AP-1突變質粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1雙突變質粒，并采用Kpn I和HindIII進行雙酶切鑒定，酶切產物電泳可得到約1.2kb小片段和4.1kb包含目的片段的大片段，與插入的TFF1啟動子目的片段和線性pGL3-Basic大小結果相符合，見圖1。

圖1 雙酶切鑒定啟動子熒光素酶報告基因注：1: undigested; 2: digested with Kpn I、HindIII; 3: DNA Marker；A：pGL3-TFF1， B：pGL3-TFF1-△ERE， C：pGL3-TFF1-△AP-1， D：pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1質粒雙酶切定。

2.2 野生型及突變型TFF1基因啟動子質粒測序鑒定結果

pGL3-TFF1質粒，pGL3-TFF1-△ERE突變質粒，pGL3-TFF1-△AP-1突變質粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1雙突變質粒DNA測序由蘇州金唯智公司完成，測序結果與本實驗中設計序列相比較，結果完全一致，證明質粒構建成功，示意圖見圖2。

2.3 野生型及突變型TFF1基因啟動子轉錄活性

將構建的4種啟動子質粒分別與內參質粒pRL-SV40共轉染人膽囊癌細胞GBC-SD細胞后，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報告基因活性，并將兩者的比值作為該啟動子的相對活性。結果如圖3A所示，與pGL3-Basic組相比較，pGL3-TFF1的基礎轉錄活性升高了約2.20倍，pGL3-TFF1-△ERE突變質粒的轉錄活性升高約了1.5倍，pGL3-TFF1-△AP-1突變質粒的轉錄活性升高了0.076倍，pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1雙突變質粒的轉錄活性升高了0.056倍。表明AP-1結合位點的基因序列對TFF1基因啟動子的轉錄活性具有關鍵作用。

圖2 野生型及突變型TFF1基因啟動子的熒光素酶報告載體示意圖

為了進一步檢驗雌激素與TFF1蛋白表達的關系，我們將各啟動子質粒分別轉染進人膽囊癌細胞GBC-SD細胞后，給與10-9mol·L-1外源性雌激素刺激24 h，后測定各組熒光強度。實驗結果如圖3B所示，與無雌激素處理組比較，雌激素能顯著升高野生型pGL3-TFF1質粒和突變型pGL3-TFF1-△ERE質粒的轉錄活性(P<0.001。但對pGL3-TFF1-△AP-1突變質粒和pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1雙突變質粒的轉錄活性影響不大。

圖3 雙熒光素酶報告基因檢測啟動子轉錄活性注：A：啟動子突變對TFF1轉錄活性的影響。雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測構建的啟動子質粒的基礎轉錄活性，與空白對照組比較，***P<0.001。B:雌激素對膽囊癌TFF1表達的影響。E2代表該組經雌激素處理，pGL3-basic-luc為空載質粒。雌激素刺激組與無雌激素刺激組相比較，TFF1轉錄活性顯著升高，***P<0.001；與雌激素刺激的野生型TFF1啟動子組相比較，AP-1位點突變以及雙位點突變組TFF1轉錄活性極顯著性降低，###P<0.001。

3 討論

三葉因子家族是一類小分子調節肽，包括3個成員TFF1、TFF2、TFF3。其中TFF1又稱為雌激素誘發蛋白，是經典的雌激素應答基因。正常情況下主要在胃體和胃竇粘膜上皮表達[8]。目前研究認為TFF1的異常表達是多種疾病發生發展的重要病理學基礎，如TFF1表達缺失引起胃腸粘膜慢性損傷[9]。在正常的膽囊組織中無TFF1的表達，但在膽囊炎、不典型增生以及膽囊癌出現時大量表達。Kornprat在研究中也證實了這一點，其研究指出TFF1在正常粘膜中不表達，上皮細胞出現炎癥改變時開始表達，并且在35%的原位癌以及24%的轉移癌患者癌組織中檢測到TFF1的免疫反應性，且隨著腫瘤分期與分級的增加，TFF1的免疫反應性是顯著降低的，這說明TFF1可能是膽囊結石、膽囊炎和膽囊癌之間某種缺失的聯系[10]。但目前膽囊癌中TFF1蛋白表達的調控機制仍未有報道，雌激素以及雌激素受體在膽囊癌發生發展過程中的作用機制也未闡明。

本實驗成功構建了野生型和突變型TFF1基因啟動子雙熒光素酶報告質粒，并通過瞬時轉染將其成功轉染進了膽囊癌細胞GBC-SD。根據上述的實驗結果，我們得知ERE位點和AP-1位點同樣參與到了膽囊癌中TFF1的調控，但ERE作為雌激素的應答元件，其在膽囊癌中發揮的作用是有限的，TFF1的表達調控更多依賴的是AP-1結合位點。膽囊組織作為一個非性激素靶器官，其ER的表達存在一定限制，這可能是限制ERE位點發揮調控作用的一個原因。本研究為將來深入了解膽囊癌發病機理，及其發生發展過程提供一定的理論依據。