乙二胺四乙酸對食源性混合病原菌生物被膜的抑制作用

張鈺皎，胡煒東，孫子羽，滿都拉，黃海英，趙雪平，陳忠軍，*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018；2.內蒙古農業大學職業技術學院，內蒙古包頭014109）

細菌生物被膜（biofilm）是菌體黏附于接觸表面后，通過分泌大量多糖、蛋白質和核酸等胞外基質將自身包裹在其中而形成的微生物聚集物[1]。食源性病原菌可以黏附于食品接觸表面生長繁殖而形成生物被膜，食源性病原菌生物被膜會對食品安全造成巨大隱患。在自然條件下，大多數生物被膜是由多種病原菌形成的混合病原菌生物被膜[2-3]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門氏菌（Salmonella）在食品加工過程中極易聯合作用而形成混合菌生物被膜[4]。混合病原菌生物被膜中的微生物相互交叉感染，導致微生物的多樣性增加，進而使得其對外界的抵抗能力加強，更難以被抗生素等抑菌劑殺滅清除[5]。

乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）是一種具有強配位能力的有機螯合-絡合劑，能和金屬離子形成穩定的水溶性絡合物[6]。乙二胺四乙酸及其金屬鹽被廣泛應用于各個領域，在工業生產中EDTA 常被用作掩蔽劑以控制金屬離子濃度并抑制催化反應；在醫學衛生中EDTA 可與人體中放射性金屬配位從而起到解毒作用；在食品加工中添加其金屬鹽不僅可以提高油脂的抗氧化能力，還能起到殺菌作用[7-9]。目前大多研究集中于乙二胺四乙酸及其金屬鹽對食源性病原菌單一生物被膜的抑制作用，對混合菌生物被膜的研究鮮少。

本文探究乙二胺四乙酸及其金屬鹽對食源性病原菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌）形成的混合菌生物被膜的抑制作用，為有效控制食品加工環境中的混合菌生物被膜提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 11775-3、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003-3、沙門氏菌（Salmonella）ATCC 14028、哈維弧菌（V.harveyi BB170）：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

結晶紫、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、草酸銨、無水甲醇、33 %冰醋酸、無水乙醇（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養基（tryptone soy broth，TSB）：北京陸橋生物技術有限公司；AB 培養基：0.3 mol NaCL，0.05 mol MgSO4，0.2%酸水解酪蛋白用KOH 調節pH7.5，121℃高壓滅菌20 min，冷卻后每100 mL 培養基中加入以下無菌物質：1 mL 1 mol 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），1 mL 0.1 mol 精氨酸和 2 mL 50%甘油。

1.2 儀器與設備

Synergy H1 全功能微孔板檢測儀：美國伯騰儀器有限公司；LDZX 全自動高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；JY 系列電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；SW-CJ-2DF 雙人單面凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；GHP 隔水式恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；XH-C 漩渦混勻器：常州未來儀器制造有限公司；TM4000 plus 掃描電鏡：日本株式會社日立高新技術那珂事業所。

1.3 方法

1.3.1 食源性病原菌生物被膜的制備

將活化后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌分別接種于TSB 培養基中，于恒溫振蕩培養箱（37 ℃、120 r/min）培養過夜，將菌懸液稀釋至OD600nm=0.1（約為1.5×108cfu/mL）備用。將上述稀釋的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌菌懸液 1 ∶1 ∶1（體積比）混合后，以體積比1%的接種量分別接種于事先裝有200 μL TSB 培養基的 96 孔微量板中，37 ℃下培養 24 h 后，微孔板檢測儀測其630 nm 下的光密度值A1，空白對照記為A1C?？瞻讓φ战M只加TSB 培養基，且試驗組及對照組均進行3 次平行試驗[10]。

1.3.2 結晶紫染色法測定生物被膜的黏附率（B 值）

將96 孔板中培養結束后的培養液棄去，并于每空中加入300 μL 的磷酸鹽緩沖液沖洗，反復沖洗3 次以去除未黏附的浮游菌；然后于每孔中添加200 μL 無水甲醇固定15 min，棄去懸浮液后于60 ℃下干燥1 h；隨后添加200 μL 的2%結晶紫染液染色20 min，蒸餾水沖洗孔壁至沖洗液無色；干燥后于每孔中添加300 μL的33%冰醋酸靜置10 min；微孔板檢測儀震蕩10 min后測定A2和A2c[11]。生物被膜黏附率（B 值）的計算公式為：

式中：A1、A2為培養和染色后的光密度值；A1c、A2c為空白對照的光密度值。

1.3.3 EDTA 對混合菌生物被膜形成的影響

1.3.3.1 EDTA 濃度對混合菌生物被膜形成的影響

采用二倍稀釋法配制不同濃度的乙二胺四乙酸溶液，將其加入到TSB 培養基中使其最終質量濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L[12]。96 微量孔板中每孔加入200 uL 含不同EDTA 質量濃度的TSB 培養基，以1%的接種量加入食源性混合菌菌懸液（金黃色葡萄球菌-大腸桿菌-沙門氏菌）后于37 ℃下培養24 后測其黏附率，平行試驗3 次，并以不同濃度EDTA 對3 種食源性病原菌單獨形成生物被膜的抑制作用進行對比。

1.3.3.2 EDTA 加入時間對混合菌生物被膜形成的影響

96 孔板接種混合菌菌懸液后分別于37 ℃下培養 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h 時加入0.25 mmol/L 的EDTA，并以未加EDTA 的不同時間段黏附率作對比，繪制未含EDTA 和含EDTA 的混合菌生物被膜的生長曲線[13]。

1.3.3.3 二價陽離子對混合菌生物被膜形成的影響

在含有 0.25 mmol/L EDTA 的 TSB 中加入 Mg2+、Ca2+、Fe2+，接種1%的混合菌菌懸液并于37 ℃下培養24 h 后測其生物被膜黏附率[14]。

1.3.3.4 不同濃度EDTA 對混合菌AI-2 活性的影響

V.harveyi BB170 活化后于 30 ℃、200 r/min 培養過夜，將菌懸液稀釋至OD630nm=0.4 后用新鮮AB 培養基稀釋5 000 倍備用?；旌暇鷳乙航臃N于含0、0.25、0.5、1、2 mmol/L EDTA 的 TSB 培養基中 37 ℃下培養24 h 后，于13 000 r/min 下離心5 min 后取其上清液。上清液經0.22 μm 濾膜過濾后，取20 μL 過濾后的上清液加入事先裝有200 μLTSB 培養基的96 孔微量板中，并取20 μL TSB 培養基加入事先裝有200 μLTSB培養基的96 孔微量板中作為對照。30 ℃、120 r/min 恒溫培養，Synergy H1 全功能微孔板檢測儀每1 h 測一次發光值，直至5 h，試驗結果以相對活性強度表示[15]。

1.3.3.5 掃描電鏡觀察EDTA 對混合菌生物被膜形成的影響

將經無水乙醇浸泡過夜的0.5 cm×0.5 cm 的鐵片滅菌后放于含有 0、0.25、0.5、1、2 mmol/L EDTA 的 TSB培養基試管中，接種1%的混合菌菌懸液后37 ℃下連續培養5 d 后即可形成穩定的生物被膜。將培養后的鐵片用鑷子取出，用無菌PBS 漂洗以去除浮游菌，放于4 ℃預冷的2.5%戊二醛浸泡4 h 后，依次用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇浸泡10 min，再用100%的乙醇中浸泡2 次，每次15 min。醋酸異戊酯置換2 次，每次15 min 后冷凍干燥，噴金后用掃描電鏡觀察[16]。

2 結果與分析

2.1 EDTA濃度對混合菌生物被膜形成的影響

不同濃度EDTA 對單一食源性病原菌生物被膜和混合菌生物被膜的抑制作用如圖1 所示。

圖1 EDTA 質量濃度對生物被膜黏附率的影響Fig.1 Effect of EDTA mass concentration on the adhesion rate of biofilm

由圖1 可知，隨EDTA 質量濃度的增加，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌分別形成的單一菌生物被膜及混合菌生物被膜的黏附度均逐漸降低。未添加EDTA 時，混合菌的黏附度為0.038 9，當添加0.25 mmol/L 的EDTA 時，其黏附度下降了16.5%，當添加EDTA 的質量濃度逐漸增大時，黏附度下降雖有所減緩，但仍起到了抑制作用；未添加EDTA 時，金黃色葡萄球菌的黏附度為0.097 2、大腸桿菌為0.074 2、沙門氏菌為0.031 1，混合菌生物被膜的黏附度明顯低于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌單獨形成生物被膜的黏附度，但高于沙門氏菌，這是因為在混合菌生物被膜中的三株菌互相存在著競爭作用，尤其是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌間的競爭力較強，這導致了混合菌生物被膜的黏附度要低于單一菌；當添加不同質量濃度的EDTA 時，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌單獨形成生物被膜的抑制率明顯高于EDTA 對混合菌生物被膜的抑制率，因混合菌生物被膜中的菌種間的相互作用，使得其分泌的胞外多糖等物質復雜多樣，從而增強了混合菌生物被膜的抵抗力。這符合Wang 等[17]研究發現，食源性病原菌腸道沙門氏菌（Salmonella enterica） 和血清型鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）形成的混合病原菌生物被膜比單菌株生物膜更具耐藥性。

2.2 EDTA加入時間對混合菌生物被膜形成的影響

EDTA 加入時間對生物被膜黏附率的影響見圖2。

圖2 EDTA 加入時間對生物被膜黏附率的影響Fig.2 Effect of EDTA join time on the adhesion rate of biofilm

從圖2 可看出，隨著培養時間的增加，混合菌生物被膜的黏附度呈現先增加后減少的趨勢，培養24 h 時黏附度高達0.038 6；當階段性添加EDTA 后，混合菌黏附度同未含EDTA 時的趨勢相同；4 h～28 h 間的各個階段添加0.25 mmol/L EDTA 時，其明顯低于未含EDTA 的黏附度，尤其在培養初期時，黏附度下降了53.5%；隨著時間的增加，混合菌生物被膜的黏附度逐漸降低，在培養24 h 時黏附度下降率僅為15.3%；但在培養32 h～48 h 的各個階段加入EDTA 后基本無抑菌作用。因與同種微生物的浮游狀態相比，生物被膜的形成是十分復雜的，需歷經4 個時期，即黏附期、發展期、成熟期和分離期[18]。當培養32 h 時生物被膜已基本處于成熟期，此階段的生物被膜耐藥性強，會對抗生素和宿主免疫系統產生更強的抵抗力[19-20]。

2.3 二價陽離子對混合菌生物被膜形成的影響

二價金屬陽離子對生物被膜黏附率的影響見圖3。

圖3 二價金屬陽離子對生物被膜黏附率的影響Fig.3 Effect of Divalent metal cation on the adhesion rate of biofilm

如圖3 所示，在含EDTA 的培養基中分別添加了Mg2+、Ca2+、Fe2+后，EDTA-Mg、EDTA-Ca、EDTA-Fe 培養基中的混合菌生物被膜黏附度高于未含金屬離子的，混合菌生物被膜的黏附度在EDTA-Mg 中的較在只含EDTA 培養基中的增加率為2.4%、EDTA-Ca 為8.1%、EDTA-Fe 為11.4%，說明EDTA 螯合不同二價金屬離子對食源性混合菌生物被膜的形成起到了保護作用，且保護作用強度為Fe2+>Ca2+>Mg2+。Banin[21]等研究發現，特定的二價金屬陽離子（濃度可完全飽和EDTA）會使得EDTA 具有較低的親和力，且它們產生的靜電作用有助于增強生物被膜的黏性，使得混合菌生物被膜具有較強穩定性。

2.4 不同濃度EDTA對混合菌AI-2活性的影響

添加不同質量濃度的EDTA 對混合菌釋放群體感應信號分子AI-2 的影響如圖4 所示。

圖4 EDTA 質量濃度對AI-2 活性的影響Fig.4 Effect of EDTA mass concentration on AI-2 activity

V.harveyi BB170 的發光強度受到群體感應信號分子AI-2 的調控，細菌活性越強其釋放的AI-2 信號分子的活性越強，則其發光值越大。由圖4 可知，隨著EDTA 質量濃度的增大，其AI-2 相對活性逐漸降低。當僅添加0.25 mmol/L 的EDTA 時，AI-2 相對活性已明顯降低。此試驗再次證明了EDTA 對混合菌生物被膜有抑制作用，推測其可能是通過減少細菌數量和菌體活性來達到抑制作用。

2.5 掃描電鏡觀察EDTA對混合菌生物被膜形成的影響

用掃描電鏡觀察在不同濃度EDTA 影響下混合菌生物被膜形態的變化，結果見圖5～圖9。

圖5 EDTA 濃度 0 mmoL/L（×2 000）Fig.5 EDTA concentration 0 mmoL/L（×2 000）

圖6 EDTA 濃度 0.25 mmoL/L（×2 000）Fig.6 EDTA concentration 0.25 mmoL/L（×2 000）

圖7 EDTA 濃度 0.5 mmoL/L（×2 000）Fig.7 EDTA concentration 0.5 mmoL/L（×2 000）

圖8 EDTA 濃度 1 mmoL/L（×2 000）Fig.8 EDTA concentration 1 mmoL/L（×2 000）

圖9 EDTA 濃度 2 mmoL/L（×2 000）Fig.9 EDTA concentration 2 mmoL/L（×2 000）

如圖5 所示，混合菌極易在小鐵片表面黏附而形成緊密黏連的生物被膜，3 種病原菌通過分泌的胞外多糖及其它有機物質將自身及其余兩種菌包裹后在鐵片上形成大片緊密的生物被膜。在混合菌生物被膜中，金黃色葡萄球菌呈球狀，大腸桿菌和沙門氏菌呈桿狀，且球狀菌體明顯大于桿狀菌體數量，這是因為在混合菌生物被膜中，金黃色葡萄球菌為優勢菌，其生長過程中分泌的物質抑制了其它兩株菌的生長。圖6～9 體現了添加不同質量濃度的EDTA 后混合菌生物被膜的生長狀態。從圖可以看出添加0.25 mmol/L 的EDTA 培養5 d 后，其生物被膜已出現明顯的脫落，菌體以單個狀態分散，混合菌生物被膜已遭到明顯破壞；添加0.5 mmol/L 的EDTA 后混合菌生物被膜不僅生物被膜遭到破壞，且分離出的單個菌數量已明顯減少；添加1 mmol/L 的EDTA 后僅有微量浮游的單個病原菌；而添加2 mmol/L 的EDTA 后已看不見病原菌，鐵片上僅剩細菌分泌的胞外多糖等物質。這進一步證實了EDTA 對混合菌生物被膜的形成有一定的抑制作用。

3 結論

本研究以96 孔微量板作為單一菌和混合菌生物被膜的黏附載體，通過結晶紫染色法測定了不同質量濃度的EDTA 及添加二價金屬陽離子對混合菌生物被膜形成的影響，并通過群體感應信號分子活性的檢測和掃描電鏡形態的觀察進一步證實了EDTA 對混合菌生物被膜形成的影響。結果表明，EDTA 對混合菌生物被膜有抑制作用，且隨著EDTA 質量濃度的增加，混合菌生物被膜的黏附度逐漸降低；EDTA 僅對28 h（黏附期）前的混合菌生物被膜有抑制作用，當生物被膜處于32 h（成熟期）后再添加EDTA 時已基本無抑制作用；添加二價金屬陽離子Mg2+、Ca2+、Fe2+后對混合菌生物被膜起到了穩定作用；AI-2 信號分子相對活性的檢測和掃描電鏡觀察生物被膜的形態進一步證實了不同質量濃度的EDTA 對混合菌生物被膜有一定的抑制作用。

食品加工環境的不同，形成食源性病原菌生物被膜的結構也會不同，且目前國內外學者主要致力于研究EDTA 對單一菌種生物被膜的抑制作用，對混合菌生物被膜研究鮮少。因此，探究EDTA 對混合菌生物被膜的抑制作用對食品實際生產中防控混合菌生物被膜的污染具有重要意義。根據文獻[22]可知，乙二胺四乙酸作為食品添加劑時的國家標準限量為0.075 g/kg，約為0.668 mmol/L，因試驗證明在添加0.25 mmol/L 乙二胺四乙酸時對食源性混合菌生物被膜已有明顯抑制作用，因此在食品實際生產中，可選用0.25 mmol/L～0.5 mmol/L 的添加量作為對混合菌生物被膜的抑制劑。