BHMT對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞氧化損傷的保護作用

周海燕，薛雨順，嚴 宏，李 迪，王新川

0引言

晶狀體蛋白質(zhì)是晶狀體內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)蛋白，晶狀體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、溶解度改變，凝集、交聯(lián)均可導(dǎo)致光散射和晶狀體透明度改變，進而引起視力下降。大量的研究已證實蛋氨酸(Methionine，Met)對維持晶狀體透明度是非常重要的，甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(betaine-homocysteine methyl transferase，BHMT)是Met循環(huán)中重要的酶。BHMT主要在肝臟和腎皮質(zhì)中有較大量表達，它利用同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)和提供甲基的甜菜堿(betaine，Bet)催化Met的再合成[1-2]。前期我們利用基于同位素相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究分析了不同年齡人白內(nèi)障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質(zhì)，并首次報道了BHMT在高齡組白內(nèi)障晶狀體核區(qū)的水平較年輕組明顯下調(diào)，進一步通過新的臨床白內(nèi)障晶狀體標(biāo)本進行了驗證[3]。但其在晶狀體老化和白內(nèi)障形成中如何參與代謝等確切機制尚不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)，高Hcy是導(dǎo)致年齡相關(guān)性疾病的重要風(fēng)險因素[4]。除此，還與多種眼部疾病相關(guān)[5]。在白內(nèi)障的研究中，高水平的Hcy與年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病密切相關(guān)[6-7]。本研究利用BHMT基因過表達人晶狀體上皮細胞(HLEC)進行研究，觀察Hcy干預(yù)下細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白、ROS及抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶水平及凋亡相關(guān)酶Caspase-12的變化，探討B(tài)HMT在高濃度Hcy環(huán)境下對晶狀體的保護作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞和儀器與試劑HLEC-B3細胞、胎牛血清(FBS，Ausbian)、DMEM(Corning)、胰酶(上海生工生物工程股份有限公司)、Puromycin(Clontech)、D-Hanks(上海吉凱基因技術(shù)有限公司),BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(中國碧云天公司)、乳酸脫氫酶試劑、抗-GRP78試劑盒(Abcam,Cambridge,MA)、Caspase-12檢測試劑盒(Abcam,Cambridge,MA)、抗-Nrf2試劑盒(Santa Cruz Biotechnology,USA),同型半胱氨酸化合物(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)。熒光顯微鏡(奧林帕斯)、CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)、倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)、離心機(賽默飛世爾科技有限公司)、生物安全柜(上海振樣創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司)，GV358載體，AgeI/AgeI酶切(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，EdU試劑盒(C10310銳博)。

1.1.2分組將HLEC隨機分為3組。正常組：正常HLEC+10% FBS培養(yǎng)基；對照組：感染了空載體的HLEC+10% FBS培養(yǎng)基+5mmol/L Hcy；BHMT過表達組：BHMT過表達病毒感染HLEC+10% FBS培養(yǎng)基組+5mmol/L Hcy。根據(jù)Velazquez等的實驗方法[8]，孵育24h后檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2方法

1.2.1 BHMT基因過表達慢病毒載體的構(gòu)建基因BHMT(NM_001713)由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成,所擴增的BHMT基因條帶大小為1 262bp，插入經(jīng)AgeI/AgeI酶切的GV358慢病毒載體構(gòu)建GV358-BHMT慢病毒質(zhì)粒,將重組慢病毒質(zhì)粒GV358-BHMT,pHelper1.0載體，pHelper2.0混合液稀釋后，利用Lipofactamin 2000脂質(zhì)體對HEK293T細胞進行轉(zhuǎn)染，48h后收集細胞并采用Western blotting法檢測BHMT表達情況，裂解細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,一抗(1∶500)孵育過夜后給予二抗(1∶1000)孵育，漂洗后加入配置好的顯色液用ECL法結(jié)合X光片顯色。

1.2.2 BHMT基因過表達慢病毒載體感染細胞根據(jù)1.2.1構(gòu)建BHMT基因過表達慢病毒載體，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后48～72h進行病毒收獲,確定采用相應(yīng)的濃縮純化得到高滴度的慢病毒保存液,病毒感染HLEC-B3后，通過抗性篩選獲得過表達慢病毒感染細胞株，提取mRNA，經(jīng)過qPCR檢測表達水平。BHMT上游引物序列：5’-CCACTTTGACCCCACCATTA-3’；下游引物序列：5’-GCTAGCTCATTTGTGGTCATC-3’。以GAPDH基因為內(nèi)參照基因，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.2.3細胞增殖能力的測定EdU細胞增殖實驗方法：取對數(shù)生長期細胞，以每孔2 000細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段；制備適量50μmol/L EdU培養(yǎng)基；每孔加入100μL 50μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育2h，棄培養(yǎng)基；PBS清洗細胞2次，每次5min；每孔加入50μL細胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)室溫孵育30min，棄固定液。每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5min后，棄甘氨酸溶液；每孔加入100μL PBS，脫色搖床清洗5min，棄PBS；每孔加入100μL 1×Apollo染色反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30min后，棄染色反應(yīng)液；加入100μL滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)脫色搖床清洗2～3次，每次10min，棄滲透劑；每孔每次加入100μL甲醇清洗1～2次，每次5min；PBS清洗1次，每次5min；去離子水按100∶1的比例稀釋試劑F，制備適量1×Hoechst 33342反應(yīng)液，避光保存；每孔加入100μL 1×Hoechst 33342反應(yīng)液，避光、室溫、孵育30min；棄染色反應(yīng)液；加入100μL PBS清洗2次；染色后立即進行熒光顯微鏡觀測。

1.2.4氧化損傷標(biāo)志物檢測

1.2.4.1檢測ROS含量培養(yǎng)的細胞加入DCFH-DA熒光探針于培養(yǎng)基，濃度為10μmol/L。37℃孵育細胞30min，收集細胞,37℃避光30min,流式細胞儀檢測。

1.2.4.2測定GSH活性用可見分光光度計(波長420nm)測算組織中谷胱甘肽(GSH)活性：取各組樣本0.5mL，加應(yīng)用液2mL混勻，3 500～4 000r/min離心10min，取上清液1mL進行顯色反應(yīng)。混勻，靜置5min，420nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零比色測各管OD值。

1.2.4.3 Western blotting檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白(GPR78,Nrf2，Caspase-12)接收細胞樣品，PBS洗滌2次后，適量預(yù)冷的2×Lysis Buffer裂解，刮下細胞轉(zhuǎn)移入EP管中，冰上裂解10～15min后超聲破碎細胞，取上清BCA法測定蛋白濃度。加樣進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜及脫脂牛奶封閉，按照不同檢測試劑盒比例加入一抗(1∶1000)，之后于4℃冰箱內(nèi)與一抗孵育過夜，室溫漂洗后按照比例加入二抗(1∶10000)，孵育1h，再次漂洗后加入配置好的顯色液，于Bio-Rad發(fā)光成像儀顯色。蛋白質(zhì)表達量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。

2結(jié)果

2.1 Western blotting檢測BHMT蛋白表達情況重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞48h后，BHMT慢病毒轉(zhuǎn)染組細胞BHMT蛋白表達水平明顯高于正常組和空載體轉(zhuǎn)染組(圖1),表明BHMT基因過表達慢病毒載體構(gòu)建成功。

2.2 qPCR檢測BHMT mRNA表達情況采用BHMT基因過表達慢病毒載體感染HLEC-B3細胞后進行實時定量PCR檢測，所得結(jié)果與GAPDH的結(jié)果相比較，通常認為Ct值相差2以上即存在顯著差異。本實驗中正常組為1.0032±0.090，空載體感染組為1.475±0.047，BHMT慢病毒感染組為986.181±106.033，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2)，BHMT基因表達豐度明顯升高，約是正常組的986.181倍，空載體感染組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 BHMT基因過表達對HLEC增殖能力的影響利用EdU試劑盒對HLEC進行增殖能力檢測，正常組、對照組、過表達組細胞增殖能力分別為(33.342±0.045)%、(28.099±0.307)%、(58.141±0.192)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.726,P<0.05)。與正常組相比,過表達組細胞增殖比例増加,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而對照組與正常組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.4 BHMT基因過表達對氧化損傷指標(biāo)的影響細胞內(nèi)ROS水平：使用流式細胞儀行DCFH-DA定量檢測顯示,正常組、對照組、過表達組細胞內(nèi)ROS水平分別為(89.2043±0.3511)%、(91.4502±0.0606)%、(49.5625±0.4502)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=99.348,P<0.05)。與正常組相比,過表達組ROS降低,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而對照組與正常組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

2.5 BHMT高表達對HLEC內(nèi)GSH活性的影響各組GSH活性結(jié)果見表1。三組間GSH活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=93.375,P<0.05)。與正常組相比,過表達組GSH活性増加,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而對照組與正常組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 Western blotting檢測BHMT蛋白表達。

圖2 qPCR檢測BHMT mRNA表達情況 aP<0.05 vs正常組。

圖3 各實驗組細胞增殖比例 aP<0.05 vs正常組。

表1 各實驗組GSH活性

2.6 Western blotting檢測GRP78、Nrf2、Caspase-12在各組表達的差異三組GRP78相對表達量分別為1.1081±0.031、1.2433±0.020、0.2282±0.013，正常組及對照組明顯高于過表達組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正常組、對照組、過表達組Nrf2的相對表達量分別為0.1061±0.047、0.1081±0.040、0.8276±0.070，正常組與對照組明顯低于過表達組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。正常組、對照組、過表達組凋亡相關(guān)酶Caspase-12的相對表達量分別為0.3032±0.055、0.8781±0.043、0.1026±0.050，過表達組與正常組明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6，表2。

3討論

前期我們利用iTRAQ標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究分析了不同年齡人白內(nèi)障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質(zhì),并首次報道了BHMT在高齡組白內(nèi)障晶狀體核區(qū)的水平較年輕組明顯下調(diào)，進一步通過新的臨床白內(nèi)障晶狀體標(biāo)本進行了驗證[3]。但其在晶狀體老化和白內(nèi)障形成中如何參與代謝等確切機制尚不清楚。在胎兒晶狀體文庫中，BHMT是一個大量表達的基因[9]。Rao等[10]第一次在恒河猴的晶狀體核中發(fā)現(xiàn)了BHMT，其表達約占核部總蛋白的0.5%～10%，但具體機制不清。BHMT是Met循環(huán)中重要的酶,它利用Hcy和提供甲基的甜菜堿(betaine，Bet)催化Met的再合成[11-12]，是機體在生理狀況下維持Hcy穩(wěn)定代謝水平的重要功能蛋白質(zhì)。實驗研究已經(jīng)觀察到Hcy對人類和動物晶狀體上皮細胞的影響，高濃度Hcy可以誘導(dǎo)晶狀體細胞發(fā)生嚴重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展[7,13]。Hcy升高導(dǎo)致大量的活性氧的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細胞死亡和凋亡,可能導(dǎo)致了皮質(zhì)性白內(nèi)障的形成[14]。而后囊下白內(nèi)障的形成可能與玻璃體內(nèi)Hcy的含量增多有關(guān)[15]。研究認為Hcy是一種引起白內(nèi)障的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激源。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子紊亂和蛋白質(zhì)不能正常折疊導(dǎo)致細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡、生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細胞器的病理過程,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性蛋白[16]。細胞內(nèi)抵御過量ROS損傷的最重要機制是由PERK依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子(NF-E2-related factor2,Nrf2)調(diào)控的[17-18]。Nrf2調(diào)控許多抗氧化防御基因，包括GR、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶及另外的抗氧化酶。研究發(fā)現(xiàn)在相同的誘導(dǎo)條件下BHMT轉(zhuǎn)基因小鼠的高Hcy血癥發(fā)病率明顯低于對照組，并可保護肝臟細胞免受高同半胱氨酸濃度的損傷[19-20]。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)兩種miRNAs通過分化靶向海刺參中BHMT來直接影響體腔細胞中Hcy含量，靶基因BHMT siRNA或補充Hcy均可明顯促進體腔細胞ROS的產(chǎn)生，表明靶基因BHMT通過調(diào)控Hcy的含量發(fā)揮生物學(xué)功能。

圖4 各實驗組細胞內(nèi)ROS水平。

圖5 GRP78，Nrf2在各組表達的Western blotting分析。

圖6 Caspase-12在各組表達的Western blotting分析。

表2 各組細胞內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)表達

前期我們成功構(gòu)建了人晶狀體上皮細胞BHMT基因過表達慢病毒載體，在實驗中觀察到空載體感染組及BHMT慢病毒感染組的細胞增殖率及活性未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象[22]。然后觀察其對Hcy干預(yù)的人晶狀體上皮細胞的氧化損傷的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入Hcy干預(yù)后，BHMT過表達細胞內(nèi)ROS水平較正常組及對照組明顯降低，GSH活性明顯升高，提示BHMT可以在細胞接受高Hcy刺激后，減輕細胞的氧化損傷程度。Nrf2的降低也進一步說明了對照組細胞內(nèi)抵御過量ROS損傷的屏障削弱。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志性蛋白GRP78的表達較陰性對照組明顯降低，提示高Hcy啟動了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而BHMT可有效地抑制這種反應(yīng)，增強細胞的保護作用，同時抑制了凋亡相關(guān)酶Caspase-12的表達。

綜上所述，由于Hcy誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的啟動,并導(dǎo)致晶狀體上皮細胞中ROS的產(chǎn)生,ROS降低了游離谷胱甘肽的數(shù)量,削弱了氧化防御系統(tǒng)，加劇了更加氧化的環(huán)境,導(dǎo)致晶狀體發(fā)生氧化損傷。而BHMT可以抑制Hcy對細胞的氧化損傷作用，減少細胞ROS水平，升高GSH活性，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，抑制了細胞凋亡，最終表現(xiàn)為可以有效防護高Hcy環(huán)境下晶狀體上皮細胞氧化損傷。證明了其在防治與Hcy有關(guān)的疾病方面的積極作用，為白內(nèi)障氧化損傷機制提供新的依據(jù)。