生物工程角膜移植治療感染性角膜炎

林 莉

0引言

感染性角膜炎是我國主要的致盲性眼病之一。嚴重者可繼發角膜穿孔、眼內感染甚至失明。對于藥物治療無效，或角膜瀕臨穿孔的患者，往往需要手術干預[1]。以往多采取穿透性角膜移植手術，但術后炎癥反應較重，排斥機率高[2]。選擇結膜瓣遮蓋術也是一種治療手段，但愈后患者角膜瘢痕形成，影響視力恢復[3]。在感染尚未累及后彈力層時，施行深板層角膜移植術，可以盡可能地切除病灶，同時降低了術后免疫排斥的風險。而由于在我國未對器官捐獻進行立法，導致角膜供體嚴重匱乏。在這種情況下，通過我國角膜病學組多位專家的共同努力，成功研發了生物工程角膜(脫細胞角膜基質)。生物工程角膜沒有內皮細胞，僅能實施板層角膜移植手術，在一定程度上替代人角膜，緩解供體匱乏的局面。我院自2016-12/2019-02期間收治的感染性角膜炎患者采用生物工程角膜移植治療，取得較好的療效，現報道如下。

1對象和方法

1.1對象本組病例為2016-12/2019-02我院眼科收治的感染性角膜炎患者35例35眼。其中真菌性角膜炎14眼，細菌性角膜炎13眼(包括因細菌感染導致的角膜小穿孔1眼)，病毒性角膜炎8眼(表1)。男21例，女14例，年齡42～87(平均61.66±13.23)歲。上述病例均經過1wk以上的常規藥物治療，自覺癥狀沒有減輕，眼部感染未能控制，眼表潰瘍無明顯修復或有穿孔風險。觀察組使用生物工程角膜材料施行板層角膜移植手術，共15例15眼。對照1組使用保存人角膜材料施行板層角膜移植手術，共10例10眼。觀察組與對照1組為隨機分組。對于角膜病灶位于角膜邊緣，潰瘍面積較大，或者拒絕施行角膜移植手術者，納入對照2組。對照2組采用自體結膜瓣遮蓋的手術方式，共10例10眼。納入標準：(1)感染性角膜炎，角膜浸潤局限于角膜基質層，尚未穿透角膜全層者；(2)角膜穿孔位于角膜周邊，穿孔直接小于2mm者。排除標準：(1)真菌性角膜炎有明顯內皮斑和前房積膿者；(2)視力高于0.1者不納入觀察組與對照1組；(3)有明顯的眼表疾病如重度干眼、神經麻痹性角膜炎、瞼裂閉合不全等不納入觀察組和對照1組。本研究經醫院倫理委員會批準，所有需要手術的患者，經充分溝通，并告知術中使用材料，包括使用生物角膜的患者，告知生物角膜的來源，取得患者的充分理解和配合的情況下，簽署手術知情同意書及特殊耗材使用同意書后進行手術。

1.2方法

1.2.1材料準備觀察組使用的生物工程角膜為脫細胞豬角膜基質。對照1組使用的材料為-80℃冰箱冷凍保存的人角膜供體。對照2組使用的材料為自體結膜瓣組織。

1.2.2術前藥物保守治療方法手術治療前，給予常規的藥物保守治療。術前通過角膜刮片鏡檢確診為真菌性角膜炎的患者，局部滴用50g/L那他霉素滴眼液或滴用自配的10g/L伏立康唑滴眼液抗真菌治療。通過病史及臨床表現診斷為細菌性角膜炎的患者，根據臨床經驗選擇針對性的抗生素滴眼液局部點眼治療，必要時配合全身用藥。治療后根據患者臨床表現及藥敏培養結果調整藥物治療方案。通過病史及臨床表現術前診斷為病毒性角膜炎的患者，同時合并角膜潰瘍、細菌感染或壞死性角膜基質炎的情況，予以局部滴用更昔洛韋凝膠，靜滴阿昔洛韋抗病毒治療的同時，給予抗感染、促進角膜修復對癥治療。上述藥物保守治療1wk無效，角膜潰瘍未見修復，角膜瀕臨穿孔或已出現小穿孔的情況下，采取手術治療的方式。

1.2.3手術方法觀察組：術中均采用20g/L利多卡因3mL加7.5g/L布比卡因2mL行球后阻滯麻醉。使用角膜環鉆鉆切植床，角膜板層刀剖切角膜致完全切除角膜病灶。將生物工程角膜放置于平衡液中復水30s左右，以等大的角膜環鉆鉆切相應大小的生物工程角膜植片。常規臨床上行人板層角膜移植是植床的環鉆直徑比植片的環鉆直徑小0.25mm，但生物工程角膜應使用等大的環鉆。如植片比植床大，很難完成縫合，即使勉強完成縫合，也將影響切口的愈合。置生物工程角膜植片于角膜植床上，以10-0尼龍線間斷對位縫合植片與植床，使植片與植床完全貼合，用無損傷有齒鑷對合植床與植片，使植床邊緣覆蓋于植片之上，以利于角膜上皮移行覆蓋在整個植片之上。

表1 三組病例情況 眼

對照1組：術中均采用20g/L利多卡因3mL加7.5g/L布比卡因2mL行球后阻滯麻醉。使用角膜環鉆鉆切植床，角膜板層刀剖切角膜致完全切除角膜病灶。取出冷凍保存的眼球，平衡液中復水解凍以后，用角膜剪剪下帶鞏膜的角鞏膜植片，以大于角膜植床0.25mm的角膜環鉆鉆切相應大小的角膜植片，去除植片內皮及后彈力層。置角膜植片于角膜植床上，以10-0尼龍線間斷對位縫合植片與植床，使植片與植床對合整齊。

對照2組：術中使用鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉聯合20g/L利多卡因結膜下浸潤麻醉的方法。沖洗結膜囊后，盡可能完全剔除角膜病灶及壞死組織，保持角膜創面平整，根據角膜病灶范圍采取全結膜瓣遮蓋或結膜瓣搭橋的方式覆蓋角膜病灶，10-0尼龍線間斷縫合固定結膜瓣。為保持結膜瓣不過早滑脫，術畢以5-0黑絲線作臨時性瞼裂縫合1wk。

1.2.4術后用藥患者術后繼續術前抗感染治療。真菌性角膜炎患者，使用50g/L那他霉素滴眼液或滴用自配的10g/L伏立康唑滴眼液每天4次點眼。診斷為病毒性角膜炎患者，術后繼續阿昔洛韋注射液靜滴，連續使用5～7d后改為口服阿昔洛韋片0.4g/次，3次/d，持續口服3mo。口服藥物期間，需定期監測肝功能。局部滴用更昔洛韋凝膠每天4次點眼，逐漸減量至每天1次或隔日1次，持續使用6mo[4]。除真菌性角膜炎患者外，角膜植片上皮修復后，加用妥布霉素地塞米松滴眼液每天4次點眼，持續滴用2wk后改為氟米龍滴眼液點眼，逐漸減量，維持治療6mo。所有角膜移植患者術后均滴用他克莫司滴眼液每天3次預防排斥反應，逐漸減量，維持使用6～12mo。

1.2.5術后隨訪及觀察指標術后患者觀察1wk出院，所有出院患者均定期在門診隨訪復查。觀察組及對照1組患者術后前3mo，平均2wk門診復查一次，超過術后3mo者，平均1～2mo門診復查1次。1例最短隨訪時間為3mo，2例最長隨訪時間為20mo。對照2組門診隨訪時間約3mo。通過裂隙燈觀察角膜感染控制情況及角膜潰瘍愈合程度；通過裂隙燈觀察角膜及角膜植片透明度，有無新生血管生成及移植排斥反應發生；術前術后最佳矯正視力的比較；術后術眼與健眼眼壓對比；自覺癥狀的改善程度。

2結果

2.1術后角膜感染控制情況及角膜潰瘍愈合程度術后3～6d，觀察組及對照1組行角膜移植手術的病例，無論采用保存人角膜材料或生物工程角膜材料，通過角膜熒光染色，均可見角膜上皮完全覆蓋角膜植片。眼表炎癥減輕，前房未見明顯炎癥。隨訪3～20mo，觀察組中15例15眼角膜感染均得到控制，無感染復發情況。除1眼在隨訪過程中發生植片混濁，其余角膜植片均保持基本透明。該例患者在術后3mo內感染控制，無復發征象，角膜維持透明，隨訪中，最佳矯正視力0.3。術后4mo，患者角膜植片縫線松動，但未及時復診拆除縫線，植片邊緣糜爛，植片發生混濁。拆除縫線后，予以促進角膜修復治療，角膜植片再次愈合，但植片未能恢復透明性。術后1wk拆除瞼裂縫線，對照2組結膜瓣均覆蓋角膜病灶區域，縫線在位，無結膜瓣滑脫情況。除1眼因真菌感染嚴重，但術前患者拒絕施行角膜移植手術，選擇行結膜瓣遮蓋姑息治療，術后15d，結膜瓣逐漸滑脫，角膜潰瘍未見修復，真菌感染加重，出現前房積膿，患者疼痛癥狀明顯，選擇眼內容物剜除手術。其余病例，術后1mo左右，結膜瓣逐漸退縮，變薄，角膜感染得到控制，角膜潰瘍瘢痕愈合，可見新生血管長入病灶區域，角膜上皮完整。

圖1 病例1，患者男性，54歲，因左眼疼痛伴視力下降15d就診，診斷：左眼真菌性角膜炎、2型糖尿病，使用生物工程角膜施行板層角膜移植手術治療 A：術前視力手動/眼前，左眼裂隙燈照相，角膜中央區域混濁水腫，潰瘍形成，基質灰白色浸潤，化膿性改變；B：術后即時，生物角膜呈灰白色混濁，與植床貼附好；C：術后7mo，已拆除部分縫線，顳側有新生血管自角膜緣長入角膜植片，角膜植片基本透明，無感染復發；D：術后18mo，術眼矯正視力0.4，角膜植片基本透明，新生血管未完全消退。

圖2 病例2，患者男性，79歲，因右眼疼痛、發紅15d就診，診斷：右眼角膜潰瘍、雙眼慢性淚囊炎、雙眼角膜白斑、雙眼年齡相關性白內障。行右眼淚囊摘除術后2d，結膜囊干凈，無明顯分泌物，淚囊區無紅腫，使用生物工程角膜施行板層角膜移植手術治療 A：術前視力數指/眼前，裂隙燈照相情況，右眼角膜中央偏下方灰白色全層混濁伴潰瘍形成；B：術后4d，角膜熒光素鈉染色無明顯著染，上皮覆蓋角膜植片；C：術后12d，因患者全層角膜混濁，植床中下方不透明，但瞳孔區無明顯遮擋，植片輕度水腫；D：術后18d，鼻側大量新生血管長入角膜，角膜植片混濁，使用他克莫司、潑尼松龍滴眼液抗炎、抗排斥治療；E：術后2mo，炎癥逐漸減輕，角膜水腫及新生血管逐漸消退，已拆除部分縫線，鼻側有胬肉組織長入；F：術后20mo，術眼矯正視力0.05，角膜植片較前明顯透明，新生血管大部分消退，鼻側可見翼狀胬肉，晶狀體核性混濁，擬行白內障手術。

2.2術后角膜及角膜植片透明度，有無新生血管生成及移植排斥反應發生隨訪3～20mo，觀察組中14眼角膜植片維持基本透明，角膜上皮完整，患者角膜在裂隙燈下的宏觀形態見病例1～3(圖1～3)。1眼角膜植片混濁。其中2眼因植片靠近角膜緣，術后15d左右即發現有新生血管自角膜緣長入角膜植片與植床層間(病例1、2)，經過局部點他克莫司、潑尼松龍滴眼液抗排斥、抗炎治療后，新生血管逐漸萎縮，炎癥反應減輕，持續隨訪1a，見新生血管未完全消退，但對角膜透明度及視功能沒有造成較大影響。對照1組中9眼角膜植片維持透明，角膜上皮完整，未見新生血管長入。1眼因病毒感染復發，新生血管長入，角膜混濁。對照2組9眼角膜潰瘍瘢痕修復，角膜不透明，新生血管長入，角膜上皮完整。1眼因真菌感染加重，疼痛癥狀明顯，行眼內容物剜除術。

2.3治療前后視力對比以最后一次隨訪復查的視力為術后視力。本研究中，患者以老年居多，大多合并年齡相關性白內障。觀察組15例15眼術后最佳矯正視力均較術前提高，無1眼視力下降。其中1眼因細菌感染所致的周邊角膜小穿孔，術后最佳矯正視力由術前0.2提高到0.8(7%)。對照1組9例9眼術后最佳矯正視力均較術前提高，1眼視力無改變，術后最佳矯正視力0.3及以上者2眼(20%)。對照2組6眼術后最佳矯正視力較術前提高1～2行，3眼視力無改變。1眼因行眼內容物剜除，由術前視力光感下降為無光感(表2)。

圖4 患者術后前節OCT圖片和UBM圖片 A：前節OCT顯示術后18mo角膜情況；B：UBM顯示術后18mo角膜情況。

表2 三組術前術后最佳矯正視力對比 眼

2.4術后術眼與健眼眼壓對比術后患者于門診隨訪，監測眼壓情況，根據隨訪結果發現觀察組中術眼較對側健眼眼壓普遍偏低3～6mmHg。術后18mo，前節OCT測量術眼與對側健眼的角膜厚度無明顯差異(圖4A)。UBM顯示，術后角膜保持正常弧度及表面光滑度(圖4B)。而對照組中，術眼與對側健眼眼壓對比無明顯差異。

2.5自覺癥狀改善程度術后1～2wk，觀察組患者眼部疼痛、畏光流淚癥狀均不同程度減輕或消失，1眼于術后4mo因角膜縫線松動致角膜植片邊緣溶解，出現眼部異物感等不適癥狀，予以拆除松動的角膜縫線，配戴角膜繃帶鏡，促進角膜修復對癥治療后，角膜植片與植床愈合，眼部不適癥狀消失。對照1組于術后1～2wk眼部疼痛、畏光流淚癥狀均不同程度的減輕或消失，1眼于術后2.5mo發生病毒感染復發，經藥物保守治療控制后，癥狀逐漸改善。對照2組除1眼真菌感染加重外，其余9眼于術后1～2wk眼部疼痛、畏光流淚癥狀逐漸減輕或消失，于術后3wk左右拆除結膜瓣縫線后，眼部刺激癥狀完全緩解。

3討論

角膜病是我國的第二大致盲性眼病，角膜盲患者占盲人總數的1/4[1]。面對我國現有的角膜盲患者與逐年增長的角膜盲患者的需求，我國的角膜供體嚴重不足，絕大多數患者在黑暗中排隊等待，有的甚至錯過了最佳治療時機。早在2001年美國加利福尼亞州和中國臺灣2個研究小組,則分別報道了通過植入實驗室培植的角膜給盲人帶來光明的事例，預示著生物角膜將使患者重見光明[5]。張燕等[6]曾對在北京同仁眼科中心實施了角膜移植手術，以及在北京同仁眼庫登記擬實施角膜移植手術的患者進行了一個問卷調查，以此來了解角膜盲患者對異種角膜的接受度。結論是大多數角膜移植患者能接受動物角膜的移植,他們主要在意的是使用動物角膜移植的結果。所以，除了因為個人信仰等原因，不論是利用生物角膜還是人角膜供體進行角膜移植手術，只要能帶來好的治療效果，患者普遍是可以接受的。通過前期的開發和臨床試驗，由我國科學家自主研發的脫細胞角膜基質，全球首個生物工程角膜于2015年獲得了上市批準。生物工程角膜是脫細胞豬角膜基質，取材于豬眼角膜，經病毒滅活與脫細胞等工藝制備而成，其主要成分為膠原纖維骨架結構，保留了天然角膜的前彈力層和部分基質層，移植于受體角膜植床以后，由受體的角膜細胞附著、移行、增生到生物角膜基質中去，促進組織再生和修復。其作用機制是在手術切除角膜病灶后，使用生物角膜覆蓋于角膜病灶缺損區域，保護角膜創面，引導基質膠原合成及上皮再生，可逐漸被機體細胞所改建，形成與正常角膜相似的結構，恢復角膜的透明性[7]。

生物工程角膜中去除了生物細胞和其他抗原性物質，故術后發生炎癥反應和免疫排斥反應的機率較低。張明昌教授等在中國率先開展了生物角膜應用于人體的臨床研究，并報道了使用生物角膜移植治療真菌性角膜感染的病例。最終得出結論，應用脫細胞豬角膜基質進行板層角膜移植治療真菌性角膜潰瘍安全有效，并且還有治療其他臨床疾病的潛力[8]。在本研究中，不論是使用生物角膜或人角膜行板層角膜移植的患者，術后均局部滴用他克莫司滴眼液6mo左右，預防移植排斥反應，在隨訪的20mo內，生物角膜未見發生嚴重的排斥反應。作為板層角膜移植的供體，生物角膜主要應用于感染性角膜炎，通過與人角膜供體對比，其透明度接近于人角膜，在植床角膜內皮細胞正常，感染得到控制后，可以維持角膜基本透明。術后上皮完全覆蓋角膜植片的愈合時間為3～6d，與人角膜供體移植的愈合時間基本一致。而觀察中發現，與人角膜供體不同的是，術后早期生物角膜是一種灰白色不透明的形態，但隨著炎癥的控制和時間的推移，在術后1mo左右，生物角膜植片逐漸變得透明，水腫完全消失。需要注意的是，術中取材為與植床相等大小的植片，縫合角膜后，對合植片與植床，需要讓植床完全覆蓋植片邊緣，否則上皮難以覆蓋角膜植片，植片與植床愈合困難，嚴重者將出現角膜植片溶解，而導致移植失敗。同時我們發現生物角膜術后更早出現縫線松動，需要根據情況，在術后3～7mo即拆除所有角膜縫線。如角膜縫線松動，但未能及時拆除縫線，則有可能形成植片潰瘍，進而導致植片的溶解壞死。

病毒性角膜炎的患者因為病毒感染易復發而出現角膜溶解的風險，術后長期、規律的口服及局部使用抗病毒藥物對于防止病毒感染復發非常重要。目前生物角膜投入使用的時間尚短，移植術后部分患者可能因為植片愈合不良或感染復發等情況，而出現角膜植片溶解。故確保患者的規律隨訪復查及依從性可以提高手術成功率以及植片的存活率。對于術后發生病毒感染復發的情況，必要時可以聯合羊膜移植或結膜瓣遮蓋，促進植片潰瘍的愈合，避免植片溶解。

本研究觀察組中15例使用生物角膜移植的患者，術中縫合時發現生物角膜植片較人角膜植片偏軟，彈性略低于人角膜供體。故術后監測眼壓發現術眼眼壓普遍低于對側健眼，考慮與生物角膜的硬度與彈性有關[9]。術中縫合時注意不要過度的牽拉植片，否則將導致植片嚴重變形，而影響植片與植床的愈合。通過術后前節OCT及UBM檢查發現，觀察組中所有生物角膜植片愈合后均保持了正常的角膜厚度及弧度，與人角膜供體無明顯差異。

Akanda等[10]通過研究發現穿透性角膜移植手術相對于板層角膜移植手術來說，有更高的移植排斥風險和移植失敗率。而深板層角膜移植排斥反應較少，且植片存活率增加[11-12]。我們知道，當角膜處于炎性反應活動期時，若行穿透性角膜移植手術，屬于高危角膜移植范圍，術后免疫排斥反應發生率高，長期預后差，易導致移植失敗。對于面積較大，位于角膜周邊部的潰瘍，藥物保守治療經久不愈的，也可以實施結膜瓣遮蓋手術，通過與角膜病變區域的密切接觸將結膜的營養物質運送到角膜表面,從而達到抗感染，促進角膜炎癥消退和潰瘍愈合的目的。同時,結膜瓣遮蓋也起到機械性保護創面的作用,減輕局部炎癥刺激,加速潰瘍修復的過程[13]。結膜瓣遮蓋術因為不需要角膜供體，取材于自身，手術過程相對簡單，可操作性強，使一些藥物治療無效的復雜性角膜潰瘍能盡快愈合,達到控制炎癥、挽救眼球的目的,并為患者進一步施行其他手術治療創造條件。但因角膜潰瘍瘢痕愈合，新生血管長入，視力難以恢復。且術后遺留結膜瘢痕，部分患者可能出現瞼球粘連等情況，影響外觀。所以在感染性角膜炎中，選擇病灶未累及角膜全層的病例，通過施行板層角膜移植手術，可及時去除角膜病灶，達到控制感染，提高視力的目的。對于細菌性角膜炎，即使有反應性的前房積膿，術中仍可施行深板層角膜移植，去除角膜壞死組織后，通過角膜側切口行前房沖洗，清除前房膿液，術后繼續抗感染治療，不影響治療效果。這種情況下，對于急需手術控制感染，卻沒有人角膜供體時，使用生物工程角膜是非常好的人角膜供體的替代品。生物工程角膜屬于標準化的生產，干燥保存，且有不同厚度，可以滿足臨床上各類的板層角膜移植需求。在人角膜供體極為匱乏的情況下，為解決逐年增長的角膜病患者與短缺的角膜供體材料之間的矛盾，使用生物工程角膜移植最大程度地替代人角膜供體施行板層角膜移植術，為患者保住眼球，帶來復明的希望。

在本研究中，生物角膜的透明度接近于人角膜，在角膜炎癥和感染控制、角膜水腫消退以后，可以恢復到基本透明的狀態。如植床靠近角膜緣處，容易有新生血管長入植片內，從而引發排斥反應。一般術后5mo左右才開始發現角膜植片上皮下有少量神經纖維長入[14]，所以即使移植成功，上皮完全覆蓋的角膜植片，后期仍可能出現植片與植床交界處的上皮反復脫落，嚴重者將發生角膜植片的自溶，需要長期的隨訪觀察，不能掉以輕心?？傊?，生物工程角膜是一種新型的角膜供體材料，目前尚未得到臨床上廣泛的應用。對于其臨床價值和意義還值得進一步的研究和深入的探討，以發現生物工程角膜的價值，從而拓寬角膜植片供體的來源，解決角膜供體稀缺的問題，造福越來越多的角膜盲患者。