［N2，2，2，2］BF4的合成及其對雙水相體系成相行為的影響

余 壘，朱新儒，曾 穎，李 雄，張海德

（海南大學食品學院，海南海口570228）

離子液體（ILs）是一種完全由離子組成，在室溫或者接近室溫下呈液體狀態的低溫熔融鹽，是一類新型的綠色溶劑，近年來已在化工反應、環境保護、制備新型材料等方面獲得了突飛猛進的發展［1］，但常見的咪唑型、吡啶型離子液體昂貴的價格在一定程度上也限制了它們的應用范圍，而價格較低的季銨型離子液體具有制備簡單、電導率高、熔點低、熱穩定性和電化學穩定性好等優點，越來越得到廣大研究者的關注［2-3］。

聚乙二醇（PEG）具有很高的生物降解性、低毒、低熔點、低成本等優點，通常被用作雙水相系統中的一種成相劑［4］，但是，富含PEG的一相較低的極性及PEG本身只能通過改變相對分子質量或分子結構的這種特點限制了它的應用范圍［5］。為突破這種局限，R.C.S de Sousa 等［6］研究了不同離子液體作為助劑對PEG-鹽雙水相系統分離生物分子分配行為的影響，得出離子液體作為助劑能改變共存相的特性和生物分子的分配行為，且更適合于分離疏水性較高的生物分子；S.Hamzehzadeh等［7］研究了1-丁基3-甲基咪唑溴化物離子液體作為輔助劑對PEG-磷酸鹽成相面積的影響，得出添加5%的離子液體為輔助劑增大了PEG400-磷酸鹽和PEG600-磷酸鹽雙水相的成相面積，且得出離子液體與富含PEG的上相具有更好的親和性的結論；R.L.de Souza等［8］研究了使用離子液體作為助劑萃取分離兩種探針染料，增加了雙水相區域的面積，離子液體的存在改變了染料在雙水相體系的分配系數，使得探針染料富集于PEG相，并得出離子液體與疏水相間存在更強烈的相互作用的結論；I.V.Lucena等［9］通過添加5%質子型離子液體為PEG-硫酸銨雙水相系統的輔助劑，大大增加了辣根過氧化酶的純化效果；S.Hamzehzadeh 等［10］通過在 PEG400-檸檬酸鉀雙水相體系中加入5%的［Bmim］Br，發現L-色氨酸的萃取效率得到了明顯提高；A.M.Ferreira等［11］通過分別添加5%咪唑型和季銨型離子液體為PEG-檸檬酸鉀雙水相體系的輔助劑，與不含離子液體的雙水相體系相比，富含PEG相中免疫球蛋白G的純度增加了37%；H.Yang等［5］通過添加4%不同咪唑型離子液體為PEG600-NaH2PO4·2H2O雙水相體系的輔助劑，提高了L-苯丙氨酸的萃取效率。

本文合成了季銨型離子液體［N2，2，2，2］BF4，并對其進行1H NMR表征和純度驗證。通過研究加入少量的［N2，2，2，2］BF4對 PEG-NaH2PO4·2H2O 雙水相系統成相面積的影響，旨在尋找一種低成本有效的雙水相體系，該體系將適合在常溫下較穩定的親水性生物活性物質的分離純化研究。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

PEG400、PEG600、PEG2000、PEG4000、PEG6000，均為化學純；NaH2PO4·2H2O、三乙胺、溴乙烷等，均為分析純。

雙束紫外可見分光光度計（TU-1901）；旋轉蒸發儀（RE-2000A）；節能型智能恒溫槽（DC-1006）；恒溫磁力攪拌器（85-1）；離心機（CenceL500）；油浴鍋（DF-2A）；數顯恒溫水浴鍋（HH-8）；核磁共振儀（DP-FD-CNMR-I）；全自動水分測定儀（KF-4）。

1.2 實驗方法

1.2.1 兩步法合成季銨型離子液體［N2，2，2，2］BF4

1）合成中間體［N2，2，2，2］Br。 在 250 mL 圓底燒瓶內加入 0.1 mol的乙腈（ACN），0.2 mol的三乙胺，用恒壓滴液漏斗加入0.2 mol的溴乙烷，常溫密閉反應72 h，抽濾，置于真空干燥箱干燥48 h得到中間體產物［N2，2，2，2］Br。 合成路線見圖1。

圖1 ［N2，2，2，2］Br合成路線

2）以中間體［N2，2，2，2］Br為反應物合成季銨型離子液體［N2，2，2，2］BF4。 在 250 mL 圓底燒瓶內加入 0.1 mol［N2，2，2，2］Br和 0.11 mol NaBF4，加入100 mL乙腈溶劑，裝好冷凝回流裝置，油浴鍋溫度設置為80℃，冷凝回流6 h，抽濾，除去下層沉淀；然后將溶液于60℃旋轉蒸發儀內蒸干，得白色晶體，此為粗目標產物；然后向燒瓶內加入80 mL異丙醇，油浴鍋溫度設置為120℃，冷凝回流，待燒瓶內固體全部溶解，停止重結晶，抽濾得白色針狀濕品［N2，2，2，2］BF4，重復上述步驟，進行二次重結晶；真空干燥48 h，進行純度檢測，待固體質量不再變化，稱重，計算產率。合成路線見圖2。

圖2 ［N2，2，2，2］BF4合成路線

產率計算公式見式（1）:

式中:X為產率，%；Wa為實際產物量，g；Wp為理論產物量，g。

3）［N2，2，2，2］BF4的結構表征。 用 95%的氘代二甲基亞砜溶劑和5%的四甲基硅烷（TMS）溶解［N2，2，2，2］BF4，由核磁共振儀對其結構進行表征。

4）［N2，2，2，2］BF4水溶液標準工作曲線的繪制及純度的檢測。 準確稱量［N2，2，2，2］BF4標準樣品0.01 g，在容量瓶中定容到100 mL，得到質量濃度為100 mg/L 的［N2，2，2，2］BF4標準樣品水溶液，將其分別稀釋至 10、20、30、40、50、60、70、80、90 mg/L，以去離子水為參比，在190～300 nm波長范圍內進行掃描，確定［N2，2，2，2］BF4水溶液在紫外光區的最大吸收波長，并以離子液體水溶液的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線［12］；準確稱量實驗室自制的［N2，2，2，2］BF4離子液體，用去離子水稀釋配成不同濃度的［N2，2，2，2］BF4水溶液，以去離子水為參比，測定最大吸收波長處的吸光度，通過標準曲線計算所得 ［N2，2，2，2］BF4離子液體的實際濃度，計算所得實際濃度與理論配制濃度之比，即可得到該離子液體的純度。

1.2.2 單因素實驗

以［N2，2，2，2］Br的物質的量、乙腈用量及反應時間 3 個因素為研究對象，以［N2，2，2，2］BF4的產率為指標進行單因素實驗。

1.2.3 正交優化實驗

為獲得合成 ［N2，2，2，2］BF4的最佳工藝條件，在單因素實驗的基礎上，以［N2，2，2，2］BF4的產率為指標，設計三因素三水平的正交優化實驗。

1.2.4 相圖的繪制

在25℃條件下采用濁點法［13］繪制雙水相體系相圖。制備質量分數為 4%的［N2，2，2，2］BF4原溶液，質量分數為60%不同相對分子質量的PEG原溶液、質量分數為40%的NaH2PO4·2H2O原溶液，備用。分別稱量一定質量的 PEG 原溶液及［N2，2，2，2］BF4溶液于試管中，邊振蕩邊逐滴滴加鹽溶液，直至混合液剛好出現混濁，接著逐滴滴加蒸餾水，直至混合液變澄清，重復上述操作。每次實驗重復3次，計算平均質量。

1.2.5 數據處理

每組實驗均為3次重復實驗求平均值，采用origin8.5處理實驗數據。

2 結果與分析

2.1 ［N2，2，2，2］BF4的 1H NMR 及純度分析

用95%的氘代二甲基亞砜溶劑和5%的TMS溶解［N2，2，2，2］BF4，由核磁共振儀對其結構進行表征，所得結果如圖3所示；由紫外分光光度計測得標準 ［N2，2，2，2］BF4溶液的紫外吸收光譜圖及標準［N2，2，2，2］BF4溶液濃度與吸光度的標準曲線如圖4和圖5所示。

由圖3可知，δ=2.47～2.53為溶劑峰，在1H NMR中對譜圖峰進行了歸屬［14］，數據如下:δ=1.01～1.31為—CH2—CH3甲基上的 12個氫，δ=3.03～3.39為—CH2—N—乙基上的8個氫，兩個峰面積的比值為1.45∶1≈3∶2 與理論值符合，說明目標化合物［N2，2，2，2］BF4結構正確。

圖3 ［N2，2，2，2］BF4的核磁氫譜圖

圖4 ［N2，2，2，2］BF4水溶液的紫外吸收光譜圖

由圖4 可知，［N2，2，2，2］BF4離子液體水溶液在190～300 nm之間有單一吸收峰，最大吸收波長在205 nm處附近。因此在該最大吸收波長上利用紫外分光光度計測定離子液體的濃度符合朗伯-比耳光吸收定律，可獲得較高的準確性［12］。

圖5 標準［N2，2，2，2］BF4水溶液濃度與吸光度標準曲線

如圖5所示，線性標準工作曲線方程為y=0.01057x+0.02677，相關系數R2=0.9987，由此判斷此標準曲線可用來進行實驗室自制［N2，2，2，2］BF4離子液體濃度檢測。分別配制30、70、100 mg/L的實驗室自制［N2，2，2，2］BF4溶液，測得的吸光度代入標準曲線計算得離子液體的純度分別為:98.46%、98.51%、98.48%，經過與AgNO3反應，未發現任何沉淀，由此可知，實驗合成的離子液體純度較高［15］，經真空干燥后通過KF-4型全自動水分測定儀測定［N2，2，2，2］BF4的含水量， 使含水量在使用前保持在 6×10-4以內。

2.2 合成［N2，2，2，2］BF4的單因素與正交優化實驗

2.2.1 ［N2，2，2，2］Br的物質的量對產率的影響

固定NaBF4的量為1.1 mol不變，乙腈用量為100 mL，反應時間為6 h，反應溫度為80℃，考察［N2，2，2，2］Br的不同物質的量對產率的影響。當反應物［N2，2，2，2］Br的物質的量小于 1.0 mol時，反應產率呈上升趨勢；當反應物［N2，2，2，2］Br的物質的量等于1.0 mol時，反應產率達到高值，為89.9%；當反應物［N2，2，2，2］Br的物質的量大于 1.0 mol時，反應產率呈下降趨勢，而且，過量的［N2，2，2，2］Br會導致生成雜質產物NaBr，并且很難處理［16］。所以，最終選擇［N2，2，2，2］Br的物質的量為 1.0 mol。

2.2.2 乙腈用量對產率的影響

固定 ［N2，2，2，2］Br 的 物 質 的 量為 1.0 mol、NaBF4的量為1.1 mol不變，反應時間為6 h，反應溫度為 80 ℃，考察不同乙腈用量對［N2，2，2，2］BF4產率的影響。當反應物乙腈的用量小于100 mL時，反應產率呈上升趨勢；當反應物乙腈用量為100 mL時，反應產率達到最高，為90.4%；當反應物乙腈的用量大于100 mL時，反應產率呈下降趨勢，說明溶劑的量對離子液體產率影響較大［17］。綜合比較，最終選擇乙腈的用量為100 mL。

2.2.3 反應時間對產率的影響

固定 ［N2，2，2，2］Br的物質的量為 1.0mol、NaBF4的量為1.1 mol不變，溶劑的量為100 mL，反應溫度為 80 ℃，考察不同反應時間對［N2，2，2，2］BF4產率的影響。當反應時間小于8 h時，反應產率呈上升趨勢；當反應時間為8 h時，反應產率達到最高，為91.2%；當反應時間大于8 h時，反應產率呈下降趨勢。而且，過短或者過長的反應時間都會對反應產率的結果造成不利的影響，綜合比較，最終選擇的反應時間為8 h。

2.2.4 正交實驗結果與極差分析

根據不同單因素對產率的影響結果，以原料配比（A）、溶劑用量（B）、反應時間（C）為因素，以［N2，2，2，2］BF4的產率為指標，采用 L9（34）進行正交實驗，優化［N2，2，2，2］BF4產率的最佳影響條件。影響［N2，2，2，2］BF4產率的因素水平表見表 1，正交實驗結果與極差分析表見表2。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗結果與極差分析表

由表2可知，反應條件的選擇對產品收率有明顯的影響，產率可由59.7%提高至89.8%。通過極差分析可以得出:影響該反應的最主要的因素是反應時間，此外四乙基溴化銨與四氟硼酸鈉的物質的量比和溶劑用量對產率也有不同程度的影響；其中，溶劑用量影響最小。最佳反應條件為:A1B1C2，即n（［N2，2，2，2］Br）∶n（NaBF4）為 1∶1.1，溶劑 用量為100 mL，反應時間為8 h。選擇該反應條件做3次平行實驗，最終得到［N2，2，2，2］BF4的產率為（90.70±4.0）%。實驗結果表明，正交實驗篩選出的最佳合成條件可操作性強，重復性好，適用于季銨型離子液體［N2，2，2，2］BF4的合成。

2.3 相圖的繪制與雙節點數據的關聯

2.3.1 相圖的繪制

由濁點法［13］繪制雙水相的相圖，結果如圖6所示。由圖6可知，隨著PEG相對分子質量的增加，雙水相區域逐漸增大，這主要是因為在PEGNaH2PO4·2H2O雙水相系統中，由于靜電斥力的作用，PEG相對分子質量的增大使得體系中水化離子與PEG分子間的水不溶性增強，PEG的疏水性隨著相對分子質量的增大而增強。相同聚乙二醇濃度的條件下，聚乙二醇的相對分子質量越大，雙水相成相所需的 NaH2PO4·2H2O含量越少，雙水相相圖越靠近原點［14］。所以，各相對分子質量的PEG成相能力由大到小分別為:PEG6000+4%IL（IL代表［N2，2，2，2］BF4）、PEG4000+4%IL、PEG2000+4%IL、PEG6000、PEG4000、PEG2000、PEG600+4%IL、PEG600、PEG400+4%IL、PEG400。 由此可知，PEGNaH2PO4·2H2O雙水相系統加入4%具有疏水性的［N2，2，2，2］BF4，能夠替代雙水相中的部分 PEG，增加雙水相區域的面積，擴大成相劑成相的選擇范圍［9］。 J.B.Pereira 等［18］的研究結果也表明，離子液體自身的疏水性是雙水相成相的驅動力。

圖6 25℃下三元與四元體系組成的雙水相體系的相圖

2.3.2 相圖數據的關聯

近年來，Merchuk方程已成功應用于PEG/鹽和離子液體/鹽雙水相雙節點數據的關聯。Merchuk經驗方程形式簡潔，比Pitzer、Cabezas等半經驗半理論熱力學模型具有更廣泛的實際應用價值［19］。

由Merchuk方程［20］對相圖數據進行關聯，結果見表3和表4。Merchuk方程如式（2）所示。

式中:Y和X分別代表PEG和NaH2PO4·2H2O的質量分數；A，B和C為通過回歸方程得到的常數。

表3 25℃下通過Merchuk方程獲得的PEG-NaH2PO4·2H2O體系的標準偏差及決定系數R2

通過非線性擬合得出的相關系數A、B和C由標準偏差σ及決定系數R2對其進行評估，由表3和表4可知，R2接近于1，關聯度很好，這表明，所有相圖實驗數據能很好地適用于Merchuk方程，為后續的雙水相體系的選擇與優化奠定了理論基礎。

表4 25℃下通過Merchuk方程獲得的PEG-NaH2PO4·2H2O-4%［N2，2，2，2］BF4體系的標準偏差及決定系數 R2

3 結論

通過單因素及正交優化實驗合成了［N2，2，2，2］BF4，經1H NMR譜圖分析得知其結構正確；通過標準曲線計算得知，實驗室合成的［N2，2，2，2］BF4純度較高，產率為 90.7%；通過研究添加 4%的［N2，2，2，2］BF4對 PEG-NaH2PO4·2H2O雙水相成相面積的影響可知，隨著PEG相對分子質量的增加，成相面積逐 漸增加，其 中 ，PEG6000-NaH2PO4·2H2O-4%［N2，2，2，2］BF4雙水相的成相面積達到最大， 有利于后續雙水相成相體系的選擇。通過對相圖數據進行非線性擬合得出，決定系數R2接近于1，關聯度很好；與離子液體-鹽雙水相體系相比，PEG-鹽-離子液體雙水相體系在一定程度上減少了成本，為后續雙水相分離純化生物分子奠定了理論基礎。