玉竹連作對土壤微生物區系的影響

張 周，盛 浩，袁 紅，段良霞，張 亮

（湖南農業大學資源環境學院，湖南 長沙 410128）

玉竹（Polygonatum odoratum(Mill.)Druce），別名鈴鐺菜、尾參、地管子和甜草根，是百合科黃精屬多年生草本植物[1]，富含氨基酸、微量元素、多糖和苷類等化學成分，可增強人體免疫力，有效延緩衰老、促進淋巴細胞轉化[2]，對人體有較多用處。玉竹既可食用，又可藥用，在我國分布廣泛，較為出名的一種是湖南的湘玉竹，它已成為當地重要的經濟來源。近年來，由于玉竹連年連片種植，產地病蟲害越來越重，已嚴重影響玉竹的品質，成為玉竹生產開發的主要障礙[3]。湖南地區的玉竹大片連作不僅影響其產量和質量，對當地的土壤微生物區系和土壤養分也造成不同程度的影響。

連作障礙是指在同一塊土壤中連續栽培同種或同科作物時，即使在正常的栽培管理狀況下，也會出現生長勢變弱、產量降低、品質下降、病蟲害嚴重的現象，在日本被稱為“忌地”現象，在歐美國家被稱為“再植問題”，我國稱其為“重茬問題”[4]。植物連作通常會導致土壤養分失衡、理化性質惡變、微生物群落變化、作物自毒物質積累等[5]。基于土壤微生物群落變化的研究層面，植物連作后，由于長期受同一類根系分泌物的影響，土壤微生物群落會發生選擇性富集，導致土壤微生物群落數量發生變化，如連作后土壤中細菌、真菌和放線菌等的數量變化[6]。一般連作年限越長，土壤中微生物群落數量變化程度越大。為了解釋連作障礙的形成機理，國內外眾多學者對作物連作問題進行研究，分析了造成連作障礙的幾大原因，包括：土壤微生物生物學環境改變；土壤酸堿度改變；土壤營養成分改變；植物化感作用。大量試驗表明，土壤微生物區系變化和群落結構、病原微生物數量改變及植物的化感作用，是造成作物連作障礙主要因素之一[7-14]。

縱觀國內外各學者的大量試驗，目前研究連作對土壤生物學環境的影響，大多是與保護地蔬菜連作有關，如黃瓜、番茄、玉米等，與藥食兼用植物尤其是玉竹的相關研究少有文獻報道，其中肖嵐等[3]通過對玉竹根際土壤有機化合物的鑒定，發現玉竹連作土壤中有多種化感物質，與作物的自毒作用共同造成玉竹的連作障礙，但關于玉竹連作土壤中微生物區系的具體分析鮮見報道。

本文對連作3年的玉竹根際土壤和種植1年的玉竹根際土壤中3大類群土壤微生物（細菌、真菌、放線菌）以及主要功能微生物的數量進行了分析，以期初步探明玉竹連作對土壤微生物區系的影響，為連作障礙機理研究、提高玉竹的產量和質量、實現玉竹生產的可持續發展提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 取樣點概況及取樣方法

供試土壤采集于2018年2月，地點位于長沙縣高橋鎮玉竹種植園，采集對象為連作3年的玉竹根際土壤（板頁巖母質風化的紅壤），并以種植1年的玉竹根際土壤為對照。

采用五點法選擇采樣對象，小心剝離玉竹植株周圍土壤，并輕輕拔出，收集根表附著土壤作為根際土壤，混勻后按四分法處理，取約500 g樣品裝入塑料袋中，帶回實驗室。將采集到的土壤去除明顯可見的未分解和半分解動物、植物殘體和較大的石礫，用2 mm篩子過篩后裝入滅菌的密封塑料袋，置于4 ℃冰箱保存、備用。

1.2 培養基與試劑

細菌[15]：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、水1 L、瓊脂18 g）。

放線菌[15]：改良高氏Ⅰ號培養基（淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO31 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 3 g、水1 L、瓊脂18 g）。

真菌[15]：馬丁培養基（葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、10 g/L孟加拉紅液3.3 mL、水1 L、瓊脂18 g）。

好氧自生固氮菌[15]：瓦克斯曼77號培養基（葡萄糖10 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、FeCl3·6H2O微量、MnSO4·4H2O微量、10 g/L剛果紅溶液5 mL、蒸餾水1 L、瓊脂18 g）。

氨化細菌[15]：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（蛋白胨5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.5 g、蒸餾水1 L、K2HPO40.5 g、瓊脂18 g）。

硝化細菌[15]：氨氧化細菌（亞硝化細菌）培養基（CaCO35 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、(NH4)2SO42 g、MnSO4·4H2O 0.01 g、K2HPO40.75 g、蒸餾水1 L、NaH2PO40.25 g）。

有機磷細菌[15]：蒙金娜有機磷培養基（葡萄糖 10 g、NaCl 0.3 g、CaCO35 g、卵磷脂 0.2 g、（NH4)2SO40.5 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.3 g、蒸餾水1 L）。

無機磷細菌[15]：磷酸三鈣無機磷培養基（葡萄糖10 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、Ca3(PO4)210 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、(NH4)2SO40.5 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、NaCl 0.3 g、蒸餾水1 L、KCl 0.3 g）。

格利斯試劑A液[15]：0.5 g對氨基苯磺酸加到150 mL 200 g/L的乙酸溶液中；B液：1 g酸溶萘胺加到20 mL蒸餾水和150 mL 200 g/L的乙酸溶液中。40 g/L的鉬酸銨試劑：18 g化學純鉬酸銨結晶溶于420 mL蒸餾水，漸漸加入30 mL濃硫酸，充分振蕩，使結晶完全溶解，保存在棕色玻璃瓶中待用。還原劑：15 g化學純亞硫酸氫鈉溶于250 mL蒸餾水中，加入1.5 g亞硫酸鈉和1，2，4-氨基萘酚磺酸，完全溶解后，用蒸餾水稀釋至500 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 3大土壤微生物的計數

分別稱取10 g新鮮連作土樣和對照土樣，加入盛有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，置于搖床中振蕩15 min，制備使土樣均勻地分散在稀釋液中的土壤懸液；吸取0.5 mL土壤懸液到4.5 mL無菌水中，按10倍法依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液[15]。

細菌：用0～100 μL移液槍各吸取100 μL 10-5、10-6稀釋土壤懸液，接入牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養基表面的懸液涂抹均勻，每一個稀釋度3個重復。將平板倒置，在培養箱中28 ℃培養3～4 d后觀察并計數。

放線菌：用0～100 μL移液槍各吸取100 μL 10-4、10-5稀釋土壤懸液，接入改良高氏Ⅰ號培養基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養基表面的懸液涂抹均勻，每一個稀釋度3個重復。將平板倒置，28 ℃培養5～7 d后觀察并計數。

真菌：用0～100 μL移液槍各吸取100 μL 10-2、10-3稀釋土壤懸液，接入馬丁培養基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養基表面的懸液涂抹均勻，每一個稀釋度3個重復。將平板倒置，在培養箱中28℃培養2～3 d后觀察并計數。

1.3.2 主要功能土壤微生物計數

好氧自生固氮菌：用0～100 μL固氮移液槍各吸取100 μL 10-2、10-3稀釋土壤懸液，接入瓦克斯曼77號培養基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養基表面的懸液涂抹均勻，每一個稀釋度3個重復。將平板倒置，在培養箱中28 ℃培養7 d后觀察并計數[15]。

氨化細菌：用0～100 μL移液槍各吸取100 μL 10-5、10-6稀釋土壤懸液，接入牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養基表面的懸液涂抹均勻每一個稀釋度3個重復。將平板倒置，在培養箱中28 ℃培養5～7 d后觀察并計數[15]。

硝化細菌：用1.0～5.0 mL移液槍各吸取1 mL 10-5、10-6稀釋土壤懸液，接入裝有5 mL氨氧化細菌（亞硝化細菌）培養基的試管中，每一個稀釋度接種3個試管，另取2只培養基接種無菌水作對照。在培養箱中28 ℃培養14 d，吸取培養液5滴于白瓷板穴中，依次加入格利斯試劑A液、B液各1滴，如有亞硝酸（NO2）存在，則呈紅色，表示亞硝酸化細菌存在。依據“最大或然數法”計算結果[15]。

有機磷細菌：用1.0～5.0 mL移液槍各吸取1 mL 10-4、10-5、10-6稀釋土壤懸液，接入裝有5 mL蒙金娜有機磷培養基的試管中，每一個稀釋度4個重復，另取6只培養基接種無菌水作對照。在培養箱中28 ℃培養5 d，加40 g/L的鉬酸銨試劑2 mL于試管中，在沸水浴中加熱2 min。取出后加入還原劑1 mL，有磷酸時呈藍色反應。依據“最大或然數法”計算結果[15]。

無機磷細菌：用0～100 μL移液槍各吸取100 μL 10-5、10-6稀釋土壤懸液，接入磷酸三鈣無機磷培養基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養基表面的懸液涂抹均勻，每一個稀釋度3個重復。將平板倒置，在培養箱中28 ℃培養7 d后觀察并計數[15]。

1.4 微生物數量計算公式

1.4.1 涂布法

菌數＝（菌落平均數×稀釋倍數×20×鮮土質量）/干土質量，單位為CFU/g[15]。

1.4.2 最大或然數法

菌數＝（近似值×數量指標首位稀釋倍數×鮮土質量）/干土質量，單位為CFU/g[15]。

1.5 數據分析

采用Microsoft Excel 2010軟件對試驗所得數據進行分析并繪制圖表，采用DPS 7.05軟件對數據進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 玉竹連作對土壤3大類群微生物區系的影響

玉竹連作影響土壤3大類群微生物的區系，由表1知，連作玉竹根際土壤與種植1年玉竹的土壤3大類群微生物的數量均表現為細菌＞放線菌＞真菌。與對照相比，連作土壤中細菌和放線菌的數量均減少，而真菌的數量增多。連作根際土壤細菌、放線菌總數分別比對照降低了12.4%、13.2%，且均與對照差異顯著。連作根際土壤真菌總數達1.05×106CFU/g，較對照顯著增加了239%。

2.2 玉竹連作對土壤功能微生物的影響

2.2.1 玉竹連作對土壤好氧自生固氮菌、氨化細菌、硝化細菌數量的影響

從圖1可以看出，連作玉竹根際土壤中的好氧自生固氮菌和氨化細菌數量均少于種植1年玉竹的土壤中的數量，而硝化細菌數量則大致相同。其中，連作玉竹根際土壤中好氧自生固氮菌的數量為2.51×106CFU/g，氨化細菌的數量為2.74×107CFU/g，種植1年玉竹的土壤中好氧自生固氮菌的數量為3.87×106CFU/g，氨化細菌的數量為5.33×107CFU/g。經過分析，連作后土壤中的好氧自生固氮菌數量僅為種植1年玉竹的土壤中的64.9%，數量變化差異未達到顯著水平。連作根際土壤中的氨化細菌的數量較種植1年玉竹的土壤中的數量減少了將近36.3%，數量變化差異顯著。連作玉竹根際土壤中硝化細菌的數量和種植1年玉竹的土壤中硝化細菌的數量均大約為1.45×106CFU/g，分別占連作玉竹根際土壤和種植1年玉竹的土壤中的細菌總數的0.004 2和0.003 7。

2.2.2 玉竹連作對土壤有機磷細菌、無機磷細菌數量的影響

從圖2可知，種植1年玉竹的土壤中的有機磷細菌的數量為1.45×106CFU/g，連作玉竹根際土壤中的有機磷細菌的數量為1.65×106CFU/g，兩者相差約12.1%。連作玉竹根際土壤和種植1年玉竹的土壤中的有機磷細菌的數量相差不多，但連作玉竹土壤中無機磷細菌數量為1.24×107CFU/g，對照土壤中無機磷細菌數量為4.29×107CFU/g，約是連作玉竹根際土壤中無機磷細菌的3.5倍。

3 結論與討論

土壤中的細菌、放線菌和真菌的數量是衡量土壤中微生物區系狀況的一個重要指標。大量研究表明，連作后土壤中細菌和放線菌的數量急劇下降，真菌的數量顯著上升。劉曄等[16]對不同連作年限對植煙土壤微生物區系的研究發現，細菌、放線菌數量隨連作年限的增加而減少，但真菌數量變化相反，隨著連作年限的增加而增加。黃玉茜等[17]的研究發現，隨連作年限增加，花生根際土壤中的細菌數量和放線菌數量減幅明顯，同時真菌數量增加幅度較大。本研究結果表明，經過3年的連作，細菌和放線菌數量顯著減少，而真菌的數量則大幅度增加。土壤中細菌和放線菌數量減少，真菌數量增加，會使得植物很容易被土傳病害感染，同時土壤的肥力也會在一定程度上被削弱。

表1 細菌、放線菌與真菌數量

圖1 玉竹連作對土壤好氧自生固氮菌、氨化細菌、硝化細菌數量的影響

圖2 玉竹連作對土壤有機磷細菌和無機磷細菌數量的影響

除了土壤中的3大類群微生物（細菌、放線菌、真菌）的數量在連作后會發生明顯變化，土壤中的功能微生物數量也會發生一定的變化。連作玉竹根際土壤中的好氧自生固氮菌、氨化細菌、無機磷細菌的數量均有不同程度的減少，而有機磷細菌和硝化細菌的數量變化不大。功能微生物的減少，會導致土壤中的微生物量碳和微生物量氮相對減少，從而影響植物的生長質量和最終的產量。

連作年限的增加，會使得土壤微生物的區系發生變化，從而影響玉竹生長的土壤環境，進而影響玉竹的產量、質量，甚至影響連作地塊的土壤肥力。故采取一定的措施如合理的施用有機肥和無機肥改善土壤中微生物的區系，對改良土壤和植物良好生長有一定的穩定作用。