姜黃素對機械牽張引發的Ⅱ型肺泡上皮細胞ezrin/Akt通路及炎性因子的影響

朱衛華，覃 煜，王成中

0 引言

呼吸機所致肺損傷(VILI)是急性肺損傷(ALI)及呼吸窘迫綜合征(ARDS)等患者接受機械通氣支持治療時最常見的并發癥，而其導致的不良反應機制是因為較強的機械牽張應力引起效應細胞活化，從而產生大量的炎癥因子促使肺損傷[1-2]。姜黃素主要提取于姜科、天南星科等植物的根莖，外觀黃色，為酸性多酚類物質，在生活中可作為色素及食品添加劑[3-4]。早期研究已證實姜黃素的藥理功效較多，在抗氧化、抗炎、抗病毒及抗腫瘤等方面發揮著重要作用[5-8]。也有研究發現，姜黃素能夠改善肺泡上皮細胞炎性反應及慢性阻塞性肺疾病[9-10]，但對機械牽張引發的Ⅱ型肺泡上皮細胞炎性損傷的保護作用研究較少。埃茲蛋白(ezrin)屬于一種膜骨架連接蛋白，而且其磷酸化水平與內皮細胞通透性改變相關[11]；然而，Ⅱ型肺泡上皮細胞(AT-Ⅱ細胞)ezrin蛋白是否參與姜黃素對VILI損傷的保護作用國內外尚未見研究。本文進一步研究姜黃素對VILI損傷導致的AT-Ⅱ細胞中ezrin/Akt信號通路及炎性因子的影響，以期為姜黃素的臨床應用提供參考。

1 材料及方法

1.1 實驗大鼠 10～12周齡雄性SD大鼠(260～320 g)，購于北京維利通實驗動物中心。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco-BRL公司)；全氟丙烷(天津晶明新技術有限公司)；TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA試劑盒購自武漢華美生物公司；羊抗大鼠p-ezrin、ezrin、p-Akt和Akt抗體均購自英國Abcam公司；羊抗兔二抗及化學發光檢測試劑盒購自美國Cell Signaling公司。BBS-DDC超凈工作臺(山東博科科學儀器有限公司)；LRH-150 BOD CO2細胞培養箱(上海印溪儀器表有限公司)；Victor3 1420 Multilable Counter 酶標儀(DX540，美國)；DYCZ-24DN凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)；成像系統(BIO-RAD，美國)。

1.3 AT-Ⅱ細胞分離與培養 參考文獻[12]的方法對大鼠AT-Ⅱ細胞進行分離與培養。具體步驟如下：麻醉大鼠后采用PBS灌洗肺內血液，并利用氣管插管向肺內通氣數次，至肺呈蒼白色，再向肺內灌注胰酶進行消化，清除肺門周圍結締組織，并快速剪碎組織及終止消化，4 ℃震蕩25 min，過80目、200目、280目不銹鋼篩過濾，離心收集細胞；用含10%FBS的DMEM培養基重懸，用PBS、培養液清洗細胞1次，把細胞懸液加入制作IgG包被的培養皿，37 ℃、5%CO2培養4 h，離心收集未黏附放入細胞，培養液清洗1次，堿性磷酸酶染色檢測AT-Ⅱ細胞純度，臺盼藍染色檢測細胞活力，然后進行后續實驗。

1.4 AT-Ⅱ細胞牽張刺激及藥物處理 取對數期細胞接種于6孔Bioflex彈性膜細胞培養板培養48 h后，Flexercell 4000TM應力加載系統施加20%的機械牽張應力，頻率為30 r/min，時間分別為4、8、16、24、28 h。并且采用不同濃度姜黃素(10、20、30 μmol/L)分別處理細胞16、24 h后，檢測細胞中ezrin/Akt通路蛋白及培養液中炎性因子水平。

1.5 Western blot檢測p-ezrin、ezrin、p-Akt、Akt蛋白表達 機械牽張及不同濃度姜黃素處理細胞16 h后，收集細胞，加入裂解液在冰上充分裂解細胞30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。采用12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉移至NC膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的p-ezrin、ezrin、p-Akt和Akt抗體4 ℃孵育過夜，再加入1∶3 000稀釋的二抗室溫孵育1.5 h，TBST清洗3次后ECL顯色曝光，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.6 ELISA檢測細胞培養液中TNF-α、IL-1β及IL-6水平 收集細胞培養液，離心，收集上清。嚴格按照TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA試劑盒操作說明書檢測炎性因子水平。

2 結果

2.1 VILI誘導AT-Ⅱ細胞ezrin/Akt通路p-ezrin/ezrin、p-Akt/Akt蛋白表達量的動態變化 VILI刺激AT-Ⅱ細胞4、8、16、24、48 h后，采用Western blot檢測細胞中p-ezrin、ezrin、p-Akt、Akt蛋白表達水平的動態變化，如圖1。每種蛋白在對照組細胞中均有不同程度的表達。p-ezrin蛋白表達水平在VILI刺激16 h時表達量最高，8～24 h時保持高表達水平，刺激24 h后表達逐漸下降。p-Akt蛋白表達水平在VILI刺激4 h開始逐漸升高，在16 h表達水平升至最高，刺激24、48 h表達水平降低。但VILI刺激沒有改變ezrin、Akt的表達水平，相對于對照組差異沒有明顯變化。

圖1 VILI誘導下AT-Ⅱ細胞p-ezrin和p-Akt

2.2 姜黃素對VILI誘導下AT-Ⅱ細胞中p-ezrin和p-Akt蛋白表達的影響 根據上述p-ezrin和p-Akt蛋白表達的動態變化情況，采用VILI誘導AT-Ⅱ細胞16 h構建模型。結果見圖2，VILI誘導組AT-Ⅱ細胞中p-ezrin和p-Akt蛋白表達水平相對于對照組顯著升高(P<0.05)。加入10、20、30 μmol/L姜黃素干預AT-Ⅱ細胞16 h后，均能夠不同程度地下調在VILI刺激下p-ezrin和p-Akt蛋白的表達，表現出劑量依賴性(P<0.05)。

圖2 姜黃素對p-ezrin和p-Akt蛋白表達的影響

注：1.對照組；2.VILI誘導組；3.VILI+10 μmol/L姜黃素；4.VILI+20 μmol/L姜黃素；5.VILI+30 μmol/L姜黃素。與對照組比較，*P<0.05；與VILI誘導組比較，#P<0.05

2.3 VILI誘導AT-Ⅱ細胞上清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平的動態變化 ELISA分析了VILI誘導不同時間點AT-Ⅱ細胞上清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平的動態變化，見圖3。TNF-α、IL-1β及IL-6在對照組細胞中均有分泌；VILI干預后，TNF-α、IL-1β及IL-6含量均有不同程度的升高。結果表明，在VILI刺激8 h內，這3種炎性介質的含量沒有發生明顯改變(P>0.05)；隨著刺激時間的進一步延長，在16、24、48 h時TNF-α、IL-1β及IL-6水平顯著升高(P<0.05)。

圖3 VILI誘導下AT-Ⅱ細胞上清炎性因子的動態變化

2.4 姜黃素對VILI誘導下AT-Ⅱ細胞上清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平的影響 根據“2.3”項實驗結果，將VILI刺激時間確定為24 h。VILI刺激24 h，AT-Ⅱ細胞上清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均顯著增高(P<0.05)；加入10、20、30 μmol/L姜黃素干預AT-Ⅱ細胞24 h后，均能夠不同程度地抑制炎癥介質TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，表現出劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

注：與對照組比較，*P<0.05；與VILI誘導組比較，#P<0.05

3 討論

機械通氣常用于ALI和ARDS等疾病的輔助支持治療，然而該手段也會帶來較多的并發癥，如肺損傷。目前對于VILI的發病機制存在不同的觀點，主要認為其不僅僅存在本身的機械損傷，還存在炎性介質的參與[12]。肺的組成細胞較多，機械通氣過程會引起細胞空間位置的改變及細胞間的相互作用。AT-Ⅱ細胞是VILI損傷發生時主要的效應細胞，較強的機械應力會導致AT-Ⅱ細胞結構發生變化，進一步誘導其損傷。深入探討機械通氣時AT-Ⅱ細胞骨架及相關蛋白的變化對VILI損傷的認識有著重大意義。

ezrin蛋白是一種特異的膜骨架連接蛋白，主要表達于脊椎動物的上皮細胞。早期研究已證實,ezrin蛋白與細胞間黏附、連接、細胞遷移、細胞骨架構建及腫瘤細胞的侵襲轉移等關系密切[13-14]。ezrin蛋白活化時主要表現在羧基端蘇氨酸殘基磷酸化，會進一步激活下游Akt信號通路，誘發炎性反應[15-16]。生理條件下，ezrin蛋白氨基端和羧基端形成分子內或分子鍵交聯而處于失活狀態，當外界刺激(如TNF-α、晚期糖基化終產物及凝血酶)時會誘導其磷酸化而激活，進而發揮相應的生物學效應。研究還發現,ezrin蛋白激活與臍靜脈、肺血管內皮細胞損傷及通透性關系密切。體內實驗發現,機械通氣能夠導致肺過度膨脹，引發肺內炎癥反應，進而促使AT-Ⅱ細胞損傷，引起肺上皮通透性升高及細胞功能破壞[17]。本文研究也發現,機械牽張干預后，AT-Ⅱ細胞ezrin/Akt信號通路中p-ezrin及p-Akt蛋白表達水平顯著升高，而且細胞培養液中炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的釋放量也明顯增高。

姜黃素是從姜黃屬植物根莖中提取的多酚類物質，能夠通過改變細胞因子水平發揮不同的生物學效應。姜黃素在阿爾茨海默癥、肺間質纖維化、動脈粥樣硬化等方面的應用研究較多[18]。早期研究發現,姜黃素能夠抑制炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的產生，阻斷炎性通路的活化，起著較強的抗炎作用[19]，但其具體作用機制尚不清楚。本文采用姜黃素處理VILI細胞，進一步證實不同濃度姜黃素能夠抑制TNF-α、IL-1β及IL-6的釋放水平，并且下調ezrin/Akt信號通路中p-ezrin及p-Akt蛋白的表達。初步推斷姜黃素對VILI損傷具有保護作用，其機制可能與下調ezrin/Akt信號傳導來降低炎癥因子產生有關，為防治VILI損傷提供了新的研究方向。