β-谷甾醇乙酸酯對脂質膜結構穩定性的影響

侯麗芬 - 宗珊盈 - 張海臣 -潘 麗 王宏雁 - 谷克仁, -,

(1. 河南工業大學化學化工與環境學院，河南 鄭州 450001；2. 鄭州旅游職業學院烹飪食品系，河南 鄭州 450009；3. 中檢集團中原農食產品檢測〔河南〕有限公司，河南 鄭州 450003；4. 吉林工程職業學院糧油食品學院，吉林 四平 136001；5. 河南工業大學化學糧油食品學院，河南 鄭州 450001)

近年來，納米脂質體用于食品中生物活性物質的包封和控釋已成為一種有效的手段。脂質體已成功應用于包覆抗菌肽[1]、兒茶素[2]、乳鐵蛋白[3]、抗壞血酸[4]、VE[5]和ω-3脂肪酸[6]等生物活性物質。脂質體通常是由一個或多個磷脂雙分子層包裹一定體積的水相構成的囊泡[1, 7]，主要由兩親性物質(如磷脂和甾醇等)制備[8]。膽固醇影響天然或合成膜的結構和性質，可以調節脂質膜的剛性、厚度、穩定性和流動性[9-11]。盡管膽固醇可以改善脂質體膜的特性，但患有高膽固醇血癥患者應避免食用含膽固醇的食物。

植物甾醇有降低膽固醇作用，其結構與膽固醇類似，也含有環戊烷全氫菲骨架，僅在支鏈甲基和雙鍵上存在差別。目前已有很多研究[12-14]發現植物甾醇能夠代替膽固醇來構建穩定的脂質體。與植物甾醇相比，植物甾醇酯具有較高的脂溶性，同等或更優的生物活性[15-16]，而對于植物甾醇酯摻入脂質體中的研究較少。Alexander等[17]采用植物甾醇酯制備大豆磷脂脂質體提高了水溶性制劑抗壞血酸的包封率。Wang等[18]采用高壓均質法制備植物甾醇和植物甾醇酯大豆磷脂脂質體，為傳遞生物活性成分提供了一種實用的方法。然而，關于植物甾醇酯作為輔助膜材對脂質體膜結構穩定性的研究尚未見報道。試驗擬通過薄膜—超聲法制備β-谷甾醇乙酸酯(β-Sitosterol Acetate Ester，SAE)脂質體，考察其不同摻入濃度對脂質體粒徑、PDI、電位及儲藏穩定性的影響，并探究SAE與磷脂在膜中的相互作用，以期為相關研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

大豆磷脂(SPC)：純度98%，沈陽天峰生物制藥有限公司；

β-谷甾醇(β-Sitosterol，Sito)：純度98%，上海依赫生物科技有限公司；

β-谷甾醇乙酸酯(SAE)：純度97%，實驗室自制；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯仿、甲醇等：分析純。

1.2 儀器

超聲波信號發生器：HN-500型，上海超聲漢諾儀器有限公司；

旋轉蒸發器：RE52-AA型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機：VFD-2000型，上海比朗儀器制造有限公司；

傅立葉變換紅外光譜儀：PerkinElmer Spectrum TWO型，美國鉑金埃爾默股份有限公司；

激光納米粒度儀：Zetasizer Nano ZS90型，英國馬爾文儀器有限公司；

熱重儀：TGA Q50型，美國TA儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脂質體的制備 分別精密稱取一定量的SPC(80 mg)、tween-80(60 mg)和SAE(Sito)(2，4，6，8 mg)，置于圓底燒瓶中，加入10 mL有機溶劑(體積比為2∶1的三氯甲烷—甲醇溶液，)常溫溶解，旋轉蒸發除去有機溶劑(控制真空度0.06 MPa，水浴溫度50 ℃)，使壁材在圓底燒瓶壁形成一層均勻透明的薄膜，在真空度0.1 MPa下繼續旋蒸30 min，注入0.02 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4，0.15 mol/L NaCl)10 mL水化脂質薄膜10 min。所得乳液在冰浴條件下，探頭超聲(200 W，8 min，脈沖1 s/1 s)，得到呈現淡藍色乳光的脂質體，4 ℃冷藏保存待分析。按相同方法制備不含SAE(Sito)的空白脂質體。

1.3.2 脂質體的粒徑、多分散指數(PDI)和電位的測定

用高純水稀釋脂質體100倍，采用 Zetasizer Nano ZS90(DLS)測定其平均粒徑、PDI和電位。PDI反映的是脂質體粒徑分布情況，范圍為0～1。PDI<0.3，說明脂質體呈現較好的單一性分散[19]。樣品測量前，25 ℃下平衡20 s，每個樣品測量3次，每次至少運行10次，數據表示為(均值±標準差)。

1.3.3 脂質體乳液的儲藏穩定性 將制備好的脂質體放置于冰箱4 ℃左右，分別選取貯藏0，7，15，21，30 d的樣品，按照1.3.2方法采用DLS測定其粒徑、PDI和電位。

1.3.4 脂質體的冷凍干燥 取1.3.1制備的脂質體10 mL 于50 mL燒杯中，移入冷凍干燥機，首先在-20 ℃ 預冷凍4 h，然后在真空度1.0 MPa下，程序控溫保持38 h，得到脂質體冷凍產品。

1.3.5 紅外光譜分析 取少量1.3.4制備的冷凍干燥樣品，采用PerkinElmer UATR TWO傅立葉紅外光譜儀，全反射光譜測定法進行測定。光譜測定范圍4 000～400 cm-1，儀器分辨率4 cm-1，掃描次數16。

1.3.6 熱重(TGA)分析 TGA分析脂質體的熱穩定性。冷凍干燥樣品加熱溫度范圍40～600 ℃，升溫速率10 ℃/min，氮氣流速60 mL/min。

1.4 數據處理與分析

采用Origin 8.0對試驗數據進行處理，以(平均值±標準偏差)表示。采用SPSS 21.0對數據進行相關統計學分析，P<0.05有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 粒徑與PDI

采用薄膜—超聲法制備小單室脂質體，SAE的不同摻入量對脂質體粒徑和PDI的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著SAE摻入量的增加，保持其他成分不變，加入0～6 mg SAE的脂質體粒徑無顯著差別(P<0.05)，增加至8 mg時，粒徑顯著增大。PDI隨著SAE摻入量的增加而逐漸增大，其中2 mg和4 mg的PDI無明顯差異，分別為0.22和0.23。試驗中SAE最大添加量8 mg，但是此時得到的脂質體粒徑和PDI與對照樣品相比均明顯增大，可能是因為超出了其溶解度而破壞了脂質體結構。甾醇酯在磷脂膜中的溶解度很低，Zajicek等[20]報道膽固醇酯在完全水化的磷脂雙層膜中溶解度非常有限，遠遠低于膽固醇。同時，Salmon等[21]研究表明膽固醇酯的最大摻入量隨鏈長的增加而降低，例如蛋黃卵磷脂構成的多層膜中膽固醇酯的摻入量從膽固醇辛酸酯摩爾分數的5%到硬脂酸酯摩爾分數的1.4%，但是小單室脂質體的最大摻入量比多層膜高1.2～2.0倍。

圖1 SAE摻入量對脂質體粒徑和PDI的影響

Figure 1 The effects of SAE incorporation on particle size and polydispersity index of liposome

Sito的不同摻入量對脂質體粒徑和PDI的影響如圖2 所示。由圖2可知，隨著Sito摻入量的增加對粒徑無明顯影響，而對PDI值有緩慢增加的趨勢。已有研究[22]表明少量加入Sito對粒徑影響不大，可能是少量Sito的加入填補了磷脂分子間的空隙，而對粒徑無顯著影響。同時Samar等[23]研究得出膽固醇在低濃度下(摩爾分數<5%)未顯現出增強DPPC膜有序性的作用。Sito與膽固醇結構相似，在脂質體膜中有相似的作用。

圖2 Sito摻入量對脂質體粒徑和PDI的影響

通過對比得出，在添加量為2，4 mg時，SAE和Sito有相似的粒徑和PDI。

試驗中摻入SAE的脂質體電位與對照樣品無顯著差異，為-19.1～-20.5 mV。Monica等[24]同樣采用薄膜—超聲法制備了含有膽固醇硬脂酸酯的脂質體，發現脂質體電位有稍微的降低。這一點在試驗中不明顯。

2.2 儲藏穩定性

SAE和Sito不同摻入量脂質體在4 ℃下放置不同時間的粒徑變化如圖3所示。由圖3(a)看出，在4 ℃下0～15 d，2～4 mg SAE脂質體粒徑先增加后減??；15 d后粒徑緩慢增大。而對于6～8 mg SAE脂質體來說，放置不同時間后，粒徑均比0 d小，而且無明顯規律性；這主要是由于此濃度下的脂質體在放置過程中出現不同程度的絮狀沉淀(試驗過程中肉眼觀察)，導致樣品取樣不均勻，同時也反映出其儲藏穩定性較差。由圖3(b)可知，2～4 mg Sito脂質體與相同摻入量的SAE脂質體變化一致。而6～8 mg Sito脂質體隨著放置時間的延長，粒徑緩慢增大，但無沉淀出現，與楊斌等[25]的研究結果相一致。

SAE和Sito不同摻入量脂質體在4 ℃下放置不同時間的PDI變化如圖4所示。SAE摻入量為2，4 mg的脂質體PDI變化與Sito摻入量為2～8 mg的脂質體PDI變化一致，呈現先降低然后增加的趨勢；且放置21 d后，均低于未摻入SAE和Sito的脂質體。而6～8 mg SAE脂質體的PDI由于放置過程中出現沉淀導致檢測樣品不均勻，因此無參考價值。

在4 ℃下儲藏，與Sito脂質體相比較，SAE脂質體摻入量為2，4 mg的粒徑變化較小，在30 d內可以保持較好的粒度分布性，說明其具有較好的儲藏穩定性。

2.3 紅外光譜分析

經過冷凍干燥的SAE和Sito脂質體紅外光譜見圖5。波數2 925 cm-1和2 850 cm-1分別與CH2不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動有關，表明脂質膜雙層?；湹淖兓痆26]。由表1可知，少量SAE和Sito的摻入并未與?；湴l生明顯作用，同時與膜的界面羰基水化狀態有關的C═O對稱伸縮振動峰(V C═O)也未發生明顯變化。但是，空白脂質體的P═O反對稱伸縮振動峰(Vas P═O)為1 246 cm-1，而SAE脂質體遷移至1 241(2 mg)，1 245(4 mg) cm-1，Sito脂質體遷移至1 243(2 mg)，1 245(4 mg)cm-1。同時，可以看到P═O對稱伸縮振動峰(Vs P═O)，從空白脂質體的1 096 cm-1移至SAE脂質體的1 088，1 094 cm-1，Sito脂質體移至1 089，1 092 cm-1，且相應的峰強度也發生了變化。Vas P═O和Vs P═O降低說明脂質體與外來物質間的氫鍵增強了[27]。與Sito脂質體不同的是 (CH3)3N對稱伸縮峰[V(CH3)3N]，SAE脂質體由968 cm-1變為970 cm-1(2 mg)和965 cm-1(4 mg)；而Sito脂質體無明顯變化，丁武孝等[28]也研究發現膽固醇的羥基與季銨基團無靜電作用。

圖3 SAE和Sito摻入脂質體在4 ℃下放置

Figure 3 The effects of incorporation of SAE and Sito on particle size of liposomes at 4 ℃ at different times

圖4 SAE和Sito摻入脂質體在4 ℃下放置

Figure 4 The effects of SAE and Sito incorporation on polydispersity index of liposomes placed at 4 ℃ at different times

由上可知，SAE摻入脂質體中與磷脂的P═O和(CH3)3N之間有明顯相互作用，而Sito僅與磷脂的P═O產生氫鍵。氫鍵的形成說明摻入物質與磷脂在脂質膜中結合緊密，有利于膜結構的穩定[29]。

圖5 SAE摻入脂質體的紅外圖譜

圖6 Sito摻入脂質體的紅外圖譜

表1 不同脂質體對應的紅外特征峰的波數

2.4 熱重分析

采用熱重法(TGA)測定冷凍干燥后SAE、Sito和未摻入脂質體經歷高溫的物理化學變化，如圖7所示。熱重分析結果顯示，未摻入脂質體最后剩余質量的48.0%；2，4 mg SAE脂質體分別為46.4%和46.7%；Sito脂質體為47.1%，無顯著差異(P<0.05)。圖7中顯示了不同脂質體的降解曲線，第一階段重量的減少主要與樣品中含有水分和揮發性物質有關[30-31]，未摻入脂質體減少2.5%、2 mg SAE和4 mg SAE脂質體分別減少為3.4%和3.7%、4 mg Sito脂質體減少1.8%。在較高速率降解階段，2，4 mg SAE脂質體分別在187～358，218～337 ℃時，穩定性高于未摻入脂質體；4 mg Sito脂質體在183～314 ℃時，穩定性高于未摻入脂質體。這是由于摻入SAE和Sito能使脂質體極性基團的氫鍵增強。張繼芬等[29]也發現外來物質與磷脂形成氫鍵后會一定程度提高脂質體的熱穩定性。

圖7 SAE、Sito和未摻入脂質體的TGA分析

3 結論

試驗將SAE摻入大豆磷脂脂質體中，考察其對所構建的脂質膜結構穩定性的影響。研究證明低摻入量的SAE脂質體粒度分布均勻，微觀形貌較好，且具有較好的儲藏穩定性。少量添加SAE與膜中磷脂分子極性頭基形成氫鍵，提高了脂質體的熱穩定性，起到了與Sito相似的穩定膜結構的作用。SAE保留了Sito大部分的官能團，摻入脂質體中還可能會引起脂質體的抗氧化性、包埋和釋放性能的改變，因此，需要進一步開展相關的研究。