短小芽孢桿菌堿性β-葡萄糖苷酶在畢赤酵母中的表達及酶學性質研究

闞勁松 - 張 敏 徐 濤

(合肥學院生物與環境工程系，安徽 合肥 230601)

β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21)具有β-糖苷鍵水解和合成(轉糖苷)雙重活性作用[1-2]，微生物來源的β-葡萄糖苷酶在食品工業具有重要的應用價值[3]。β-葡萄糖苷酶的水解作用源于非還原端斷裂β-糖苷鍵釋放D-葡萄糖和糖基配體，一方面可將纖維低聚糖和纖維二糖水解成葡萄糖，對纖維素糖化獲得單糖進行后續發酵具有關鍵性作用[4]，另一方面可將難以被人體吸收的天然糖苷類物質如大豆苷等水解成易于吸收利用的苷元形式[5]，也可以酶解多種不同糖苷鍵合態的香味前體物質，釋放天然香氣的風味物質[6]，在β-葡萄糖苷酶的轉糖苷作用下生成功能性低聚糖[7-8]，堿性條件下更有利于形成聚合物[9]。功能性低聚糖如低聚龍膽糖、低聚纖維寡糖等可以作為益生元的功能性糖類，其中低聚龍膽糖比麥芽糖漿具有更高的吸水性和較低的黏度，可防止食品中的淀粉老化和保持食品中的水分，對雙歧桿菌具有較強的增殖作用[10]。

多數生物傾向于利用64種密碼子中的一部分，被頻繁利用的稱為最佳密碼子，未被經常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子，密碼子的偏愛性是影響外源蛋白質異源表達的關鍵因素。巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統是發展迅速的真核表達系統[11]，相對原核表達來說，其外源基因穩定、分泌表達產物易于純化及能進行蛋白翻譯后加工修飾等特性使其得到廣泛應用，已成功表達幾種真核生物的β-葡萄糖苷酶基因[12-14]。由于畢赤酵母對密碼子的偏愛性，對目的基因的來源特別是原核基因序列需進行優化才能提高表達產物量。

前期研究已實現短小芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中的克隆和表達，但大量表達產物易形成包涵體，導致酶活力較低，且需細胞破碎后才能分離產物。短小芽孢桿菌F1株β-葡萄糖苷酶基因中編碼部分氨基酸(Arg、Pro、Cys和Ala等)的密碼子在畢赤酵母中的使用頻率較低。試驗擬將細菌Bacilluspumilus的β-葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母中進行優化表達，以期提高表達量和胞外酶活力，并測定其酶學性質，為β-葡萄糖苷酶在食品工業的應用及后續研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株及質粒

短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)F1株：本實驗室篩選獲得并保藏；

E.coliDH5α：生工生物工程(上海)股份有限公司；

畢赤酵母GS115、畢赤酵母表達載體pPICZαA：美國Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑

LB培養基、質粒提取試劑盒、博來霉素(Zeocin)、PCR 產物純化試劑盒、T4DNA連接酶、DNA 相對分子質量標準、凝膠回收試劑盒、牛血清蛋白、考馬斯亮藍R-250、Bradford蛋白質試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

EcoR I、NotI、SacI：美國Fermentas(MBI)公司；

對硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)：美國Sigma公司；

糖苷(七葉苷、苦杏仁苷、水楊苷、大豆苷、柚皮苷、D-海藻糖、熊果糖)、葡萄糖含量檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

高速冷凍離心機：Allegra 64R Centrifuge型，美國BECKMAN COULTER公司；

紫外—可見分光光度計：Libra S22型，英國Biochrom 公司；

PCR儀：Applied Biosystems 2720 Therml Cycler型，美國ABI公司；

凝膠成像系統：BioSens 810型，上海山富科學儀器有限公司；

電穿孔儀：MicroPulser型，美國Bio-Rad公司；

高效液相色譜儀：Waters 1525/Alltech ELSD 2000ES型，美國Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1β-葡萄糖苷酶基因遺傳密碼的優化設計 在保持氨基酸序列不變的前提下，以畢赤酵母密碼子使用頻率為基準，利用密碼子優化軟件(http://www.jcat.de)對β-葡萄糖苷酶基因進行密碼子優化設計，獲得β-葡萄糖苷酶基因序列(bglK)。為方便基因重組和重組酶的純化，基因編碼序列5’端引入EcoR I限制酶位點，3’端增加6×His標簽序列后再加上NotI限制酶位點。優化后的全基因序列進行人工合成后連接到pUC57載體，合成的全基因片段經測序分析完全正確后，用于酵母表達質粒的構建。

1.2.2 畢赤酵母表達載體的構建和轉化 含有人工全合成基因的pUC57載體經EcoR I和NotI雙酶切后，凝膠電泳分離基因bglK，T4連接酶16 ℃連接與經相同雙酶切的pPICZαA載體片段，CaCl2法轉入E.coliDH5α中，氨芐抗性(100 μg/mL)平板篩選重組菌，獲得陽性轉化子，提取質粒進行酶切和測序分析驗證。重組質粒pPICZαA-bglK經SacI線性化后，加入200 μL畢赤酵母GS115感受態細胞并輕輕混勻，轉入2 mm預冷電轉化杯中，冰上放置5 min，放入電轉化儀電擊后涂板，30 ℃培養2 d至轉化子出現，通過含不同Zeocin濃度(100，200，500，1 000 μg/mL)的YPD平板篩選多拷貝高表達轉化子。使用載體通用引物進行PCR鑒定轉化子，5’AOX引物序列：GACTGGTTCCAATTGACAAGC，3’AOX引物序列：GGATGTCAGAATGCCATTTGC，陽性對照以pPICZαA-bglK質粒為模板，pPICZαA-bglK轉化子記為GS115/pPICZαA-bglK。

1.2.3 畢赤酵母工程菌株的分泌表達與鑒定 將多拷貝陽性轉化子、GS115及GS115/pPICZαA空載畢赤酵母單克隆分別接種5.0 mL YPD液體培養基，30 ℃、220 r/min培養12 h，按10%的接種量轉種含25 mL BMGY培養基的搖瓶中，30 ℃、250 r/min搖床培養至OD600 nm為2～6，室溫離心收集菌體，輕輕倒出上清液，用BMMY液體培養基將細胞重懸至OD600 nm為1.0以誘導表達。30 ℃、250 r/min 繼續培養，每24 h補加適量100%甲醇至終濃度為1.5%。每24 h取樣，12 000 r/min離心10 min收集上清液即為粗酶液，分別進行酶活力檢測、SDS-PAGE和Western Blotting鑒定。

(1) SDS-PAGE分析表達產物：600 μL樣品菌懸液離心，取200 μL上清，采用生工TCA沉淀試劑盒沉淀蛋白，最終蛋白重懸液體積為20 μL，上樣量20 μL，濃縮膠80 V，20 min，分離膠120 V，60 min，凝膠電泳結束后進行考馬斯亮藍染色20 min，脫色。

(2) Western Blotting鑒定：檢測重組β-葡萄糖苷酶的表達情況[15]，制備聚丙烯酰胺凝膠為濃縮膠5%，分離膠12%，樣品20 μL上樣。電泳參數為濃縮膠80 V，30 min；分離膠120 V，60 min。轉膜為濕轉，250 mA，52 min。5%脫脂奶粉封閉，37 ℃緩慢振蕩1 h。一抗為兔抗His標簽，1∶500稀釋，37 ℃緩慢振蕩60 min孵育一抗。二抗為羊抗兔，1∶8 000稀釋，37 ℃緩慢振蕩60 min 孵育二抗，四甲基聯苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)顯色。

1.2.4 重組β-葡萄糖苷酶活力測定 800 μL的0.05 mol/L 甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0)和100 μL的 45 mmol/L pNPG在45 ℃條件下預熱5 min，加入適當稀釋倍數的酶液100 μL，反應10 min，加入2 mol/L Na2CO3溶液2 mL終止酶反應，再加入10 mL蒸餾水混勻，取適量反應液加入比色皿中，測定OD405 nm。β-葡萄糖苷酶酶活力單位(U)定義為在最適反應條件下，每分鐘催化1 μmol底物pNPG 轉化為產物pNP所需的酶量。

1.2.5 溫度對重組酶活性的影響 在25～60 ℃(間隔5 ℃)的不同溫度下測定酶活，確定重組酶的最適反應溫度。將酶液分別在45，50，55 ℃水浴中保溫處理3 h，間隔30 min取樣，測定樣品剩余酶活力，以保溫前(0 h)樣品的酶活力為100%，計算相對酶活力，研究重組酶在不同溫度下殘留酶活隨時間變化情況，探究酶的溫度穩定性。

1.2.6 pH對重組酶活性的影響 在最適溫度45 ℃條件下，測定重組β-葡萄糖苷酶在pH 4.0～8.0(磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液)、pH 9.0～10.0(甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液)條件下的酶活，確定最適反應pH。將酶液于25 ℃分別在pH 4.0～10.0的緩沖液中保溫2 h后測定剩余酶活力，以未處理酶活力為100%，計算不同pH條件下的酶活變化情況。

1.2.7 金屬離子對重組酶活性的影響 在最適酶反應條件下，加入不同離子的溶液(終濃度為1，5 mmol/L)，以未加入金屬離子的酶活力為100%，測定重組β-葡萄糖苷酶在不同離子環境中的酶活力。

1.2.8 重組β-葡萄糖苷酶的動力學常數 以pNPG為底物，在45 ℃、pH 9.0條件下，測定不同底物濃度(0.25～40.00 mmol/L)下的反應速度，利用底物濃度和對應酶促反應速度，通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，分析重組酶的動力學常數Km和Vmax值[16]。

1.2.9 底物特異性 在最適酶反應條件下，取終濃度為0.01 g/mL的糖苷類物質作為底物，反應時間10 min，再放入100 ℃水浴中煮沸5 min終止酶反應，通過葡萄糖試劑盒測定OD505 nm值。

1.2.10 轉苷活性檢測 取1 mL粗酶液，加pH 7.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液配制50%葡萄糖濃度的反應體系，45 ℃反應48 h，煮沸10 min滅酶，0.45 μm濾膜過濾后進行HPLC檢測分析。

HPLC條件：色譜柱為Hypersil APS-2，流動相為乙腈—水(體積比70∶30)；蒸發光散射檢測器；漂移管溫度90 ℃；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量5 μL。

1.3 數據處理

取3次平行試驗的平均值，采用Excel 2010進行統計處理與作圖。

2 結果與分析

2.1 畢赤酵母重組表達載體的構建

根據畢赤酵母密碼子偏好性，優化設計源自短小芽孢桿菌F1株β-葡萄糖苷酶基因序列，將原始基因序列優化為適宜酵母表達的密碼子，以提高表達效率，優化后的基因長1 485 bp，編碼495個氨基酸。全基因序列由上海生工合成，合成基因被克隆到pUC57載體上，測序結果表明合成基因與設計的基因序列完全一致。

pUC57載體經EcoR I和NotI雙酶切后，插入經相同雙酶切的pPICZαA載體，轉化大腸桿菌DH5α，經Amp抗性篩選，提取陽性克隆質粒，電泳結果如圖1所示，重組質粒與計算值相符，合成基因成功克隆至表達載體，重組的表達載體命名為pPICZαA-bglK。SacI酶切重組表達載體，酶切后線性化片段約5 078 bp(載體3 593 bp +目的基因1 485 bp)，電泳結果與理論值相符，純化回收線性化片段進行轉化。

M. DNA marker 1. 重組質粒pPICZαA-bglK 2.SacI線性化pPICZαA-bglK

圖1SacI線性化重組質粒pPICZαA-bglK

Figure 1 Linearization of recombinant pPICZαA-bglK bySacI

2.2 重組菌株的篩選和鑒定

線性化重組質粒片段電轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，在YPD抗性平板上共篩選獲得56個轉化子，挑選7個單克隆接種YPD液體培養基，提取酵母基因組DNA進行PCR鑒定，結果見圖2。轉化子基因組擴增箭頭所指為目的基因條帶，目的基因條帶1 485 bp和載體上序列488 bp的總和約1 973 bp，PCR鑒定結果表明bglK基因已插入畢赤酵母基因組中，泳道2～8均為陽性轉化子，轉化子分別記為GS115/pPICZα-H1～H7。

M. DNA Marker 1. 陽性對照 2～8. H1～H7轉化子PCR擴增

圖2 PCR鑒定轉化子

Figure 2 PCR amplification of transformants

2.3 重組菌株的分泌表達

搖瓶發酵誘導表達72 h后取樣進行SDS-PAGE分析，由圖3可知，目標蛋白理論大小約為57.5 kD，與泳道1 相比，泳道2～8明顯出現條帶。

M. 蛋白質分子量對照 1. 陰性對照GS115/pPICZα 2～8. H1～H7轉化子發酵上清

圖3 畢赤酵母重組表達蛋白的SDS-PAGE分析

Figure 3 SDS-PAGE analysis of the expressed protein produced fromP.pastoris

2.4 Western Blotting分析

由圖4可知，在57.5 kD附近，2號泳道的一號菌株(GS115/pPICZα-H1)可見明顯的條帶信號，條帶大小與預期相符，表明短小芽孢桿菌F1株β-葡萄糖苷酶基因在

M. 蛋白質分子量Marker 1. 陰性對照 2～8. 陽性轉化子H1～H7發酵液上清

圖4 重組β-葡萄糖苷酶的Western Blotting鑒定

Figure 4 Western Blotting analysis of the recombinantβ-glucosidase

畢赤酵母中克隆并分泌表達成功。其他泳道未見顯色條帶可能是轉化子因整合酵母基因組位置不同導致蛋白表達上的差異，也可能是表達蛋白中His標簽包埋程度不同導致顯色信號差異。

2.5 重組酶的酶學性質

2.5.1 最適溫度和溫度穩定性 由圖5(a)可知，當溫度為25～45 ℃時，相對酶活呈逐漸上升趨勢；當溫度為45～60 ℃時，相對酶活逐漸下降，說明重組酶最適反應溫度為45 ℃。由圖5(b)可知，重組酶在45 ℃時非常穩定，50 ℃條件下酶的溫度半衰期為3 h，55 ℃下保溫1 h后酶活幾乎為零。不同來源的β-葡萄糖苷酶，其最適溫度分布在30～90 ℃[17]。

圖5 重組β-葡萄糖苷酶的最適溫度和溫度穩定性

2.5.2 最適pH及pH穩定性 由圖6(a)可知，伴隨pH值的改變，重組酶酶活出現明顯變化，pH處于5.0～6.0時，酶活較低；pH處于7.0～9.0時，相對酶活快速上升；pH處于9.0～10.0時，相對酶活快速降低；說明重組酶最適pH值為9.0，與文獻[17]報道的多數β-葡萄糖苷酶的最適pH(3.5～6.5)一致。由圖6(b)可知，pH在7.0～9.0時，重組酶25 ℃條件下放置3 h，依然保持80%以上的酶活力，說明重組酶在中性偏堿性條件下酶活力較高且比較穩定。

2.5.3 金屬離子對重組酶活性的影響 由圖7可知，測試的金屬離子未表現出對重組β-葡萄糖苷酶活力的促進作用；在1，5 mmol/L的處理條件下，Na+、K+、Fe2+和Mg2+對重組β-葡萄糖苷酶活力的影響不大；Ca2+在5 mmol/L 時抑制了49%的酶活；Cu2+在1，5 mmol/L時分別抑制了77%，90%的酶活。不同來源的β-葡萄糖苷酶，金屬離子對酶活力的影響差異較大，但Cu2+對多數β-葡萄糖苷酶具有抑制作用[17]。

圖6 重組β-葡萄糖苷酶的最適pH和pH穩定性

圖7 金屬離子對重組β-葡萄糖苷酶活性的影響

2.5.4 酶促反應動力學常數 誘導培養72 h，發酵液上清酶活力為25.39 U/mL。將重組β-葡萄糖苷酶與不同濃度的pNPG進行反應，測定不同底物濃度的酶促反應速度，通過雙倒數作圖法分析可知，酶促反應具有典型米氏動力學特性(圖8)，計算獲得重組酶的Km值為1.26 mmol/L，Vmax為32.15 μmol/(min·mg)。

2.5.5 底物特異性 由表1可知，重組β-葡萄糖苷酶對海藻糖、苦杏仁苷、七葉苷、水楊苷、柚皮苷等糖苷類物質有一定的水解作用，對熊果糖、麥芽糖和蔗糖等無作用，對大豆苷其相對活力為pNPG的248%。大豆異黃酮在大豆中以糖苷和苷元兩種形式存在，其中以糖苷為主要存在形式，酶水解糖苷釋放出游離的大豆異黃酮苷元易被人體吸收[18-19]。此酶對大豆苷的水解反應表現出高效催化作用，有望用于制備功能和保健食品。

圖8 重組β-葡萄糖苷酶的動力學方程

Table 1 Hydrolysis of the recombinantβ-glucosidase on some natural glycosidic substrates

糖苷類物質相對酶活/%糖苷類物質相對酶活/%pNPGlu100D-海藻糖15七葉苷64熊果糖0苦杏仁苷53蔗糖0水楊苷65麥芽糖0大豆苷248纖維二糖82柚皮苷38

2.5.6 轉苷活性 由圖9可知，HPLC圖譜顯示酶催化反應產物中，出現與龍膽二糖標樣保留時間一致的峰，表明重組酶有轉苷活性，根據峰面積計算可知，龍膽二糖含量達34.25 g/L。

圖9 轉苷反應產物HPLC分析圖譜

3 結論

試驗將細菌Bacilluspumilus來源的β-葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母中進行表達，結果表明，短小芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶基因成功在畢赤酵母中克隆與分泌表達，方便蛋白質純化，可進行高密度發酵培養，便于工業化生產。發酵上清中重組β-葡萄糖苷酶酶活力達25.39 U/mL，重組β-葡萄糖苷酶最適反應溫度45 ℃，最適pH 9.0，在中性偏堿性條件下酶活力高且比較穩定，1，5 mmol/L的Cu2+分別抑制77%，90%的酶活。重組β-葡萄糖苷酶對大豆苷的高效水解和能夠酶促合成龍膽二糖，表明其具有較高的應用開發價值，但仍需對大豆苷的水解條件及利用轉苷活性生產龍膽低聚糖的性質和條件進行優化研究，為β-葡萄糖苷酶在食品工業的應用及后續研究提供依據。