處理方式對米根霉菌Rho18清除嘔吐毒素的影響

于小番 - 張 琛 許慧卿 - 丁香麗 - 袁亞明AN -

(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225000)

嘔吐毒素又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，是一種真菌毒素，主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)產生。DON具有多種毒性作用，包括急性毒性、慢性毒性、細胞毒性、免疫毒性等，歐盟將其定為三級致癌物[1]。由于中國的膳食結構偏向于谷物，所以嘔吐毒素的危害就顯得更為突出。

現有糧食中DON清除方法主要有物理脫毒法、化學脫毒法、生物脫毒法，但物理、化學脫毒方法均有不可避免的缺陷，如造成營養品質和適口性降低[2]。因此，生物脫毒法已逐漸成為研究清除糧食中DON毒素污染的重要方向，如Binder等[3]從牛瘤胃中得到一株可將DON毒素轉化的細菌，He等[4]從雞腸道中分離出對DON毒素轉化率高達98%的芽孢桿菌。目前生物脫毒的研究僅集中于整菌株探索對霉菌毒素的降解作用，但究竟菌株是通過哪個部分、何種機制來達到清除DON的作用尚未見報道。

米根霉(Rhizopusoryzae)是中國傳統發酵食品的重要發酵菌種之一[5]，是美國FDA認證的安全菌株[6]。米根霉在生長過程中產酶種類豐富、活力高，能產生多種有機酸[7]。已有研究[8]證實根霉菌具有一定的霉菌毒素脫毒作用。試驗擬以糧食發酵中常用的米根霉菌株Rho18作為研究對象，探討其菌懸液、發酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液、細胞壁懸液對DON毒素的清除效果，以期為研究利用微生物清除糧食中DON毒素的實踐應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

米根霉菌Rho18：從傳統酒曲中選育，揚州大學食品科學與工程學院營養與食品衛生實驗室保存。

1.2 試驗材料與儀器

嘔吐毒素(DON)：美國Sigma公司；

氯化鈉、甲醇：分析純，國藥化學試劑有限公司；

DON ELISA檢測試劑盒：上海羽朵生物科技有限公司；

PDA培養基：青島高科園海博生物技術有限公司；

電子天平：GL124-1SCN型，德國Sartorius公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1F型，蘇州凈化有限公司；

臺式冷凍離心機：X-22R型，德國Allegra公司；

超聲破細胞破碎儀：JY920- IID型，新芝生物科技股份有限公司；

酶標分析儀：ZM-560型，中德伯爾生物技術有限公司；

液相色譜—質譜聯用儀：Agilent 1200-6460 QQQ型，美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌懸液及發酵上清液的制備 收集穩定期(20～32 h)的Rho18發酵液，調節濃度至1012CFU/mL，隨后以100倍稀釋，獲得高、低2個濃度(1×1012，1×1010CFU/mL)的菌液。將各濃度發酵液于4 ℃以8 000 r/min 離心10 min，收集上清液和菌體。各濃度上清液分別用0.22 μm濾膜過濾后收集，濾液即為高、低2個濃度的Rho18發酵上清液。菌體用無菌生理鹽水洗滌3次后，用生理鹽水重懸至原濃度，分別記為高、低2種濃度Rho18菌懸液，均于4 ℃保存備用。

1.3.2 全菌裂解液及細胞壁懸浮液的制備 取1.3.1中高、低濃度Rho18菌懸液，用超聲波細胞破碎儀(輸出功率700 W，間隔時間5 s，每次裂解時間5 s，裂解總時間25 min，保護溫度0 ℃)對菌懸液進行裂解(至鏡檢無完整細胞)。過濾，收集濾液，于4 ℃以12 000 r/min離心15 min，取各濃度上清液，即為高、低濃度的Rho18全菌裂解液。對各組沉淀用生理鹽水洗滌3次并重懸至原溶液體積，即為高、低濃度的Rho18細胞壁懸浮液，均于4 ℃保存備用。

1.3.3 粗提酶液的制備 取1.3.1中Rho18高、低濃度發酵上清液，于4 ℃以10 000 r/min離心20 min，上清液用0.45 μm的微孔濾膜過濾[9]收集各組濾液，即為高、低濃度的Rho18粗提酶液，均于4 ℃保存備用。

1.3.4 小麥粉樣品制備 取市售小麥粉，滅菌，測定DON含量，適量添加標品DON，調節DON含量大于特征值[(2 366±187) μg/kg[10]]，40 ℃干燥至恒重。

1.3.5 菌體成分對小麥粉中DON的清除試驗 分別取Rho18各濃度菌懸液、發酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液、細胞壁懸浮液，加入含有一定量DON的面粉樣品中，按1∶5 (g/mL)添加；以添加PBS作空白對照，于37 ℃，140 r/min的條件下孵育培養，分別在孵育5 h和10 h時取樣。

1.3.6 DON清除率的測定 樣品中DON的含量采用GB 5009.111—2016中酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定，每組設置3個平行，取平均值按式(1)計算清除率。

(1)

式中：

CR——DON清除率，%；

a0——空白樣中DON含量，μg/10 g；

a1——處理樣中DON殘留量，μg/10 g。

1.3.7 DON降解產物的定性分析 對孵育10 h后高濃度處理組的DON降解產物，參照吳娛等[11]的方法，用高效液相色譜—質譜聯用儀(HPLC-MS)進行定性分析，其中模式為SEI，探頭溫度為250 ℃。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Rho18菌懸液對DON的清除效果

不同濃度的Rho18菌懸液對小麥粉樣品中DON的清除效果如表1所示。

表1 米根霉菌Rho18菌懸液對DON的清除率?

? 小寫字母不同表示同列間的差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同行間的差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

由表1可知，低濃度Rho18菌懸液經5 h孵育處理組對DON的清除率最低(1.28%)；高濃度菌懸液經10 h孵育后對DON清除率為最高(37.13%)。孵育5，10 h時，高、低濃度Rho18菌懸液對DON的清除率存在顯著差異(P<0.05)；低濃度菌懸液組隨處理時間的延長，盡管清除率有所提高，但無顯著差異。有研究[12]證實，米根霉、匍枝根霉等根霉屬微生物可以降解由鐮刀菌屬產生的毒素。試驗表明米根霉Rho18菌株對小麥粉中的DON毒素有一定的清除作用，且清除作用在10 h內與菌液的濃度、處理時間有明顯的正相關性，但具體的清除機制有待進一步研究。

2.2 不同濃度Rho18發酵上清液對DON的清除效果

不同濃度的Rho18發酵上清液對小麥粉樣品中DON的清除效果如表2所示。

由表2可知，小麥粉樣品與高、低濃度的米根霉菌Rho18發酵上清液孵育5 h后，高濃度組DON清除率為19.44%；經過10 h孵育，高濃度組對DON的清除率(39.45%)顯著升高(P<0.05)。結果表明，Rho18發酵上清液對小麥粉樣品中的DON有清除作用，高濃度組延長孵育時間可以顯著提高DON清除率。試驗發現，孵育5，10 h后，低濃度處理組對DON的清除率顯著低于高濃度組，且低濃度組孵育5 h與10 h組間無顯著差異，可能與有效物質濃度過低有關。米根霉菌發酵上清液中主要為菌株代謝產物，含有多糖、有機酸及小分子蛋白質等多種有機物。其中部分有機酸具有還原型，可與DON毒素發生氧化還原反應。Marleen等[13]研究表明還原劑可改變單端孢酶烯族毒素的分子結構和生物活性。耿海榮等[14]篩選出的一株耐酸耐高溫的枯草芽孢桿菌，并證實其發酵上清液中含有可清除鐮刀菌產生的ZEN毒素，與試驗結果相似。

表2 米根霉菌Rho18發酵上清液對DON的清除率?

? 小寫字母不同表示同列間的差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同行間的差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

2.3 不同濃度Rho18全菌裂解液對DON的清除效果

不同濃度的Rho18裂解液對小麥粉樣品中DON的清除效果如表3所示。

表3 米根霉菌Rho18全菌裂解液對DON的清除率?

? 小寫字母不同表示同列間的差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同行間的差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

由表3可知，小麥粉樣品與不同濃度的Rho18全菌裂解液經過5 h孵育后，高濃度組DON的清除率(3.44%)顯著高于低濃度組(P<0.05)；經過10 h孵育，高濃度組DON清除率顯著提高(P<0.05)，DON清除率呈現出隨濃度升高、孵育時間增長而上升的趨勢。以上結果表明，Rho18細胞內可能含有可清除DON的物質，這種物質對DON的清除作用與作用時間、全菌裂解液濃度有關。全菌裂解液中主要包括細胞器、胞內酶和一些小分子物質。推測微生物清除DON毒素的途徑：① 自身代謝酶作用[15]；② 多膜結構的細胞器對DON毒素存在吸附作用[16]。孵育10 h的效果顯著高于5 h，可能與酶的作用時間有關。具體何種酶具有良好的清除作用還需進一步探究。

2.4 不同濃度Rho18粗提酶液對DON的清除效果

不同濃度的Rho18粗提酶液對小麥粉樣品中DON的清除效果如表4所示。

表4 米根霉菌Rho18粗提酶液對DON的清除率?

? 小寫字母不同表示同列間的差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同行間的差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

由表4可知，小麥粉樣品與不同濃度組的Rho18粗提酶液孵育不同時間后，高濃度組的DON清除率均顯著高于相同孵育時間下的低濃度組(P<0.05)，高濃度組孵育10 h后對DON的清除率可達40.84%，低濃度組經過不同孵育時間處理后無顯著差異。以上結果表明，Rho18粗提酶液對小麥粉中的DON有清除作用，作用效果受酶的作用時間、濃度影響，在高濃度下，清除效果會隨著時間的延長而增加。粗提酶液的主要成分是Rho18穩定期的胞外酶，包括淀粉酶、脂肪酶等，此階段酶活性較高。淀粉酶可將小麥淀粉水解為極限糊精，糊精對小分子物質具有一定的包埋作用[17]，可固化DON毒素，從而降低DON毒素的檢出量；脂肪酶能夠催化水解環氧化合物，可以將DON轉化為DOM-1[15]，其毒性為DON的1/55[18]。多種酶類的綜合作用，間接或直接降低了小麥淀粉中DON毒素的含量。

2.5 不同濃度Rho18細胞壁對DON的清除效果

不同濃度的Rho18細胞壁懸液對小麥粉樣品中DON的清除率如表5所示。

由表5可知，小麥粉樣品與不同濃度組的Rho18細胞壁懸液混合作用，經5 h孵育后，低濃度組(4.54%)顯著低于高濃度組(P<0.05)；處理10 h后，與處理5 h相比高濃度組對DON的清除率顯著提高(P<0.05)，低濃度組相較無顯著差異。以上結果表明，Rho18的細胞壁對小麥粉中的DON毒素有一定的清除效果。

有研究[19]表明，微生物細胞壁對真菌毒素的清除作用可能包括物理吸附和生物降解。細胞壁的吸附作用主要是通過其中的肽聚糖、甘露聚糖和葡聚糖等高分子物質實現[16]。米根霉細胞壁的主要成分為幾丁質和殼聚糖[20]，其中殼聚糖是米根霉細胞壁結構性多糖的主要成分，且大部分含1.28%左右的胺基，具有良好的吸附作用[21]。細胞壁的生物降解作用可能與細胞壁表面的酶類有關。米根霉菌細胞壁的殼聚糖對于酶具有良好的固化作用[22]，可同時吸附、固化某些酶。同時，細胞壁表面存在的一些具有類似于酶活性作用的表面蛋白，對DON也可能具有一定的降解作用。此外，米根霉菌細胞壁對金屬離子具有一定的吸附作用，Meng等[23]以米根霉細胞壁制備了同時可吸附Ni2+和Fe3+的雙吸收劑，張亞娟[24]發現黑根霉對Cd2+、Cr6+、Pb2+等重金屬有較高的吸附能力。金屬離子能夠與酶結合成金屬蛋白酶，對于酶的活性存在積極的影響[14]。因此，高濃度的Rho18細胞壁具有較高的DON清除能力可能與這些金屬離子能夠輔助米根霉菌細胞壁清除DON有關。

表5 米根霉菌Rho18細胞壁對DON的清除率?

? 小寫字母不同表示同列間的差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示同行間的差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

由表1～5可以看出，經過同一處理方式處理的米根霉Rho18與小麥粉樣品混合，其清除率與時間呈正比關系。不同方式處理的Rho18對小麥粉中DON的清除效果存在差異，其中細胞壁對DON的清除效果最好，其次是發酵上清液。米根霉菌Rho18所產的酶大部分為初級代謝產物，且細胞內外均存在[25]。試驗所制備的Rho18全菌裂解液、粗提酶液中均含有一定比例的酶或小分子代謝物質，但因各成分液所含酶系及有機物質種類存在差異，而導致不同處理的Rho18對DON的清除率存在差異。細胞壁對DON毒素除由于結構特性而存在吸附作用外，其固化的酶對于DON毒素也可能存在清除作用，因而細胞壁對DON毒素的清除效果較好。

2.6 DON降解產物的定性分析

高濃度的Rho18用不同處理方式后，與小麥粉共同孵育10 h，用LC-MS測定DON的降解產物，測定結果如圖1所示。

圖1 高濃度Rho18不同處理方式孵育10 h后降解產物的LC-MS圖譜

由圖1可知，DON標準品的相對分子質量為293.30，經過Rho18菌懸液、發酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液以及細胞壁懸液處理10 h后，均產生相對分子質量為277，281左右的兩種新物質，其中DON經Rho18懸液處理后可產生相對分子質量為279，281左右的兩種物質。以上結果表明，不同處理方式的Rho18可通過生物降解DON產生新的物質。

相關研究[16,26]顯示，DON在糖苷酶作用下可進行3C-糖苷化，生成低毒性的降解產物；同時，DON作為烯醇類化合物，含有環氧基團和羥基，環氧化合物在脂肪酶作用下可被水解。樂華愛等[27]研究證實根霉菌可產生高活性的糖苷酶，可降解DON。此外，根霉菌可產生脂肪酶[28]、酸性蛋白酶以及酒化酶系[29]，但這些酶系是否具有開C12/C13環氧基，或是在復雜酶系作用下與有機酸發生酯化反應，進一步氧化或分解DON，還需進一步論證。

3 結論

試驗結果表明，米根霉菌Rho18對DON的清除率因處理方式、濃度及孵育時間而不同，其中高濃度的Rho18細胞壁懸液與小麥粉孵育10 h后，小麥粉中嘔吐毒素的清除率最高(51.62%)，其作用機制可能與Rho18細胞壁對DON生物降解和物理吸附作用有關。LC-MS測定結果表明，經不同方式處理的米根霉Rho18與DON作用后均有新物質生成，可能與根霉菌豐富且高活性的酶系有關，但具體由何種酶系發揮主要作用，仍需進一步研究。