UPLC-MS/MS測定豬肝中五氯酚殘留量的不確定度評定

歐陽麗- 汪 輝 何 翊 陳婭婭CN - 胡婷舒 - 劉曼舒 -

(長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410016)

五氯酚(pentachlorophenol，PCP)及其鈉鹽具有殺蟲、防腐、除草等作用[1]，但具有明顯的生物毒性[2]，美國環境保護局已將其列為114種主要環境污染物之一[3-4]。中國農業部公告第193號規定禁止五氯酚用于所有食用性動物[5]。高效液相色譜—串聯質譜法因具有靈敏度高、特異性強等特點，已成為動物源性食品中五氯酚殘留量檢測的國標方法[6]。

作為衡量檢測結果可信度的重要指標[7]，測量不確定度在評定試驗結果的可信性、可比性、可接受性以及檢測過程中需注意的關鍵環節等方面都具有十分重要的意義[8]。中國實驗室國家認可委員會(CNACL)對檢測實驗室測量不確定度評定程序的制定與應用提出了明確的要求[9]。目前尚未見對動物源性食品中五氯酚殘留量的檢測結果進行不確定度評定的報道。肝臟作為代謝器官，負責處理各種代謝廢物與毒素，是五氯酚殘留量相對較高的動物源性食品，為衡量檢測結果的可信度，試驗依據GB 23200.92—2016對豬肝樣品進行檢測，并參照現行有效的化學分析中不確定度評定方法及指南[10-12]對豬肝中五氯酚殘留量的檢測結果進行不確定度評定，以期提高五氯酚殘留量測量結果的科學性，為五氯酚殘留量的檢測提供切實可行的建議。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

五氯酚鈉標準物質：純度86.0%，CAS號123333-54-0，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國MERCK公司；

豬肝：市場抽檢樣品；

實驗室用水：Milli-Q超純水；

Oasis MAX固相萃取柱：60 mg，3 mL，美國Waters公司；

超高效液相色譜—四級桿串聯質譜儀：Acquity uplc?H-Class/Xevo?tq-s micro型，美國Waters公司；

快速混勻器：SK-1型，江蘇金壇醫療儀器廠；

高速離心機：CT14D型，上海天美生化儀器設備工程有限公司；

固相萃取真空裝置：Visiprep-DL 24型，美國Sigma-Aldrich公司；

超聲波清洗器：AS3120型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

全自動高通量平行濃縮儀：MV5型，美國Labtech公司；

分析天平：XSE205型，德國Mettler-Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 五氯酚標準儲備液的制備 精確稱取五氯酚鈉12.59 mg至50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成200 μg/mL的標準儲備液，-18 ℃以下避光保存；用1 mL單標線吸量管移取1 mL五氯酚標準儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制成濃度為2 μg/mL的標準中間溶液。用1 mL單標線吸量管移取1 mL標準中間溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋并定容至刻度，稀釋成濃度為200 ng/mL的標準使用液。用移液器分別移取適量標準使用液于5支2 mL容量瓶中，用空白樣品基質溶液稀釋并定容至刻度，配制成五氯酚濃度為1，5，10，20，50 ng/mL的標準系列溶液，供超高效液相色譜—串聯質譜儀測定。

1.2.2 堿性乙腈水溶液提取 稱取均質試樣2 g于10 mL 具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入6 mL 5%三乙胺的乙腈—水溶液，渦旋1 min，超聲提取5 min。3 000 r/min離心5 min，收集上清液于一具刻度離心管中。離心后的殘渣用約6 mL 5%三乙胺的乙腈—水溶液重復上述提取步驟1次，合并上清液，混勻。

1.2.3 固相萃取凈化 將所得提取溶液轉入經過預處理的MAX固相萃取柱中，以1滴/s流速使樣品溶液全部通過固相萃取柱，棄去流出液。依次用5 mL 5%氨水溶液、5 mL甲醇、5 mL 2%甲酸的甲醇—水溶液淋洗，棄去流出液，淋洗液全部流出后，固相萃取柱用真空泵抽干5 min。以4 mL 4%甲酸甲醇溶液洗脫，15 mL具刻度試管收集洗脫液，40 ℃水浴下吹氮濃縮至1 mL，用水定容至2 mL，混勻。溶液以0.22 μm有機膜過濾，供測定。

1.2.4 液相色譜條件 色譜柱：Acquity uplc BEH C18液相色譜柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；流動相流速：0.3 mL/min；流動相：A(5 mmol/L乙酸銨溶液)+B(甲醇)，梯度洗脫程序：0.00～1.00 min，40%～100% B；1.00～5.00 min，100% B；5.01～5.50 min，100% ～40% B；5.50～9.00 min，40% B；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

1.2.5 質譜條件 離子源：電噴霧離子源，負離子模式；毛細管電壓：2.0 kV；錐孔電壓：20 V；離子源溫度：150 ℃；錐孔反吹氣流量：60 L/h；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；數據采集方式：多反應監測(MRM)。儀器參數見表1。

表1 儀器參數?

? 保留時間4.12 min；a為定量離子。

1.2.6 不確定度數學模型的建立 測量不確定度數學模型：

(1)

式中：

X——樣品中五氯酚殘留量，μg/kg；

c——由標準工作曲線獲得樣品進樣液中五氯酚的濃度，ng/mL；

V——樣品最后定容體積，mL；

m——樣品質量，g；

R——加標回收率，%；

frep——樣品測量重復性；

fc標——校準標準溶液影響因子。

2 不確定度評估

2.1 各分量不確定度來源

根據檢測過程與數學模型，標準溶液的配制與稀釋、標準曲線擬合、樣品稱量、樣品測量重復性、樣品最后定容、樣品加標回收等環節引入的不確定度為五氯酚殘留量測定結果不確定度的主要來源。

2.2 不確定度分量的量化

2.2.1 標準溶液的配制與稀釋引入的不確定度

(4) 標準中間溶液配制引入的不確定度：

(6) 標準系列溶液配制引入的不確定度：

表2 移液器引入的不確定度

(6) 標準溶液配制和稀釋引入的合成不確定度為：

2.2.2 標準曲線擬合引入的不確定度 取標準系列溶液供超高效液相色譜—串聯質譜儀測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，獲得標準工作曲線的回歸方程為：A=5 355.3c+284.9(A為峰面積，c為濃度，ng/mL)，相關系數為0.999 7，測定結果見表3。

根據式(2)～(4)計算最小二乘法擬合曲線引入的標準不確定度與相對不確定度。

表3 五氯酚標準溶液測定結果

(2)

(3)

(4)

式中：

u(curve)——標準曲線擬合引入的標準不確定度，ng/mL；

urel(curve)——標準曲線擬合引入的相對不確定度；

S(A)——殘差的標準差；

P——測定樣品溶液的次數，日常檢測中每個樣品做2個平行即P=2；

N——獲得標準曲線的標準溶液的測定次數，N=5；

α——標準曲線的斜率，α=5 355.3；

b——標準曲線的截距，b=284.9；

c0——由標準曲線擬合得到的樣品溶液中五氯酚殘留量的濃度，c0=14.4 ng/mL；

ci——第i個標準溶液的配制濃度，ng/mL；

cj——第j個由標準曲線擬合的標準溶液濃度，ng/mL；

Aj——標準溶液的峰面積。

將α，b，ci，Aj，N值代入式(3)，得S(A)=2 290.287 8；將S(A)代入式(2)，得u(curve)=0.359 1，則標準曲線擬合引入的相對不確定度μrel(curve)=0.024 94。

2.3 合成不確定度與擴展不確定度

將各不確定度分量進行合成得：

當五氯酚含量為14 μg/kg時，合成不確定度為：u=urel×c=0.099 78×14=1.4 μg/kg，選擇95%置信概率，包含因子取k=2，則擴展不確定度為：U(c樣)=u×k=3 μg/kg。豬肝中五氯酚殘留量的測量不確定度表示為：X=(14±3) μg/kg，k=2。

2.4 主要不確定度分量的相對貢獻

根據CNAS-GL006：2019規定的方法計算各不確定度分量的相對貢獻，結果如表4所示。從表4可知，樣品最后定容體積、樣品測量重復性、標準溶液的配制與稀釋引入的不確定度分量對合成不確定度的影響最大。

表4 各不確定度分量的相對貢獻

3 結論

研究對采用UPLC-MS/MS法測定豬肝中五氯酚殘留量的檢測結果進行了不確定度評定。結果顯示，樣品最后定容體積、樣品重復性測量及標準溶液的配制與稀釋等人員操作環節引入的不確定度最大，此部分不確定度的相對貢獻之和約為90%，為檢測結果不確定度的主要來源；標準工作曲線擬合和樣品稱量等環節引入不確定度分量的相對貢獻約為10%；加標回收引入的不確定度的相對貢獻最小，僅為0.27%。因此，在檢測過程中，樣品制備要均勻、建議選用純度更高的標準品、減少標準溶液的稀釋步驟、定期校準儀器，減少測定結果的不確定度，以提高測定結果的準確性。